動物細胞リボゾームRNAのin vitroプロセシング系の確立

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1マウスrRNAのin vitro転写と共役したプロセシング系に用いる鋳型DNAとして、rRNA合成開始点近傍のDNA断片と18S rRNAの5′末端を含むDNA断片を結合した数種類のミニ・ジーンを作成した。パルス・チェイス実験及びS1ヌクレアーゼ保護マッピング法による解析から、この系では18S rRNAの5′末端105塩基上流でプロセシングが生じることが明らかとなった。このin vitroで見い出されたプロセシング部位が、in vivo rRNAのプロセシングにも存在することが確認された。2プロセシングシグナルとなる流基配列を、DNA塩基から求めるため、プロセシング部位(+1)を中心に欠失変異DNAを、制限酵素切断、ヌクレアーゼBal31を用いて作成した。5′側欠失変異DNAとして-219〜-126,-219〜-55を欠失したもの2個,3′側欠失変異DNAとして+260から-24,+3,+26,+87まで欠失したもの4個を、パルス・チェイス法によりプロセシングの有無を調べた結果、この部位のプロセシングには少なくとも-219から+26の領域の塩基配列が必要であることが判明した。3プロセシングに関与する因子の存在を調べるため、マウスFM3A細胞から調製したS100(10万×g上流画分)をリン酸セルロースカラムクロマトグラフィーにより、0.1M,0.3M,0.6M,1.0MKCl溶出分画(A,B,C,Dと命名)に分けた。転写開始に必要な因子は、CとDの2分画に存在するが、このプロセシングに関与する因子はA分画に存在することが明らかとなった。このマウス由来のA分画は、ヒト由来のA又はB分画とは交換不可能であり、この部位のプロセシングは、種特異性があることが示唆された。又、A分画を30℃又は45℃,10分間前処理を行ってもプロセシング活性は存在するが、60℃,10分間の処理で活性が失われることから、このプロセシング因子は蛋白性であることが示唆された。