乳蛋白質,α-ラクトアルブミンの異種細胞での発現系の確立

乳蛋白α-乳清蛋白异源细胞表达体系的建立

• 批准号: 61580216
• 负责人: 熊谷 泉
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1986
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1986 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-61580216/
• 关键词: α-ラクトアルブミン; 酵母での分泌発現; タンパク質工学

昨年度クローニングしたヤギプレα-ラクトアルブミン(α-LA)cDNAクローン(pGLA-1)は、5´-非翻訳領域15塩基対を持ち、mRNAのほぼ全長にあたる構造を含んでいる。本研究ではこのcDNAクローンを利用して主に酵母細胞での発現系の確立を行なった。1)酵母での発現:pGLA-1のcDNA部分を酵母発現プラスミッドであるpAM82の酸性ホスファターゼプロモーターの下流に挿入し、酵母 Saccha-romyces cerevisiae pep5C株に導入した。この酵母形質転換体を低リン酸合成培地中で培養しα-LAの発現の有無を、α-LA特異抗体を用いる酵素抗体法で検討した。発現したα-LAは、培地、ペリプラズム分画及び細胞内にほぼ等量づつ存在し、全体で約400μs/lの発現量であった。培地及びペリプラズム分画に分泌されていたことより、動物細胞由来のプレα-LAのシグナルプペチドが酵母においても認識されることが示唆された。発現したα-LAは、培地及びペリプラズム分画から、α-LA特異抗体を固定化した抗体カラムにより、ほぼ均一なまでに精製できた。精製標品はSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で標準α-LAとほぼ同じ移動度を示し、このα-LAが酵母より分泌される時に正しいプロセシングが起っていることが示唆された。2)大腸菌での発現:大量発現の系として大腸菌での発現系の確立を目指した。pGLA-1のcDNA部分を大腸菌発現ベクターであるpKK-223-3のtacプロモーターの下流に挿入した。合成DNAを用いる欠失変異により、cDNAの5´-非翻訳領域及びシグナルペプチド部分を除き、tacプロモーターのリボソーム結合部位から翻訳開始コドンATGまでの距離を8塩基に調節した発現プラスミッドを構築した。現在このプラスミッドを用いて大腸菌での発現を試みている。

Last year, the cDNA library (pGLA-1) contained a 5 ′-non-inverted domain, a 5 ′-non-inverted domain, and a 5 ′-non-inverted domain. In this study, we established the development system of yeast cells by using cDNA library. 1)Yeast development:pGLA-1 cDNA fragment was introduced into yeast Saccha-romyces cerevisiae pep5C strain. The presence or absence of α-LA in culture medium and the use of α-LA specific antibody in enzyme antibody method were discussed.α-LA was found in the cell wall and in the cell wall, and the total amount of α-LA was about 400μs/l Culture and selection of yeast cells from animal cellsα-LA specific antibody was immobilized and purified. The purified standard sample is characterized by the standard α-LA and the standard α-LA mobility, and the standard α-LA is characterized by the standard α-LA and the standard α-LA. 2)Development of Escherichia coli: A system for the development of large numbers of Escherichia coli and the establishment of a system for the development of Escherichia coli are indicated. The cDNA portion of pGLA-1 was detected in Escherichia coli. The 5 ′-non-inverted domain and the 5 ′-uninverted domain of the cDNA were removed from the binding site of the synthetic DNA, and the 8 ′-uninverted domain was adjusted to construct the 5 ′-uninverted domain. Now, we're going to try to use this method to produce E. coli.

项目成果

熊谷泉: Journal of Biochemistry.

熊谷泉：生物化学杂志。