タンパク質リン酸化チロシン膜リン酸化酵素の同定を当該遺伝子のクローニング

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われわれはラット肝から精製した蛋白ホスファターゼIA(2C)の化学分析を基に、オリゴヌクレオチドプローブを合成し、まずラット肝cDNAライブラリーを、次いでラット腎cDNAライブラリーをスクリーニングし、pSTー11なるクローンを得た。このものは1602kbpの読取り枠をもち、分子量42,416の蛋白をコードしていた。推定されるアミノ酸配列中にIAからの3個のオリゴペプチドのほかに、他から報告されたIAの2個のオリゴペプチドも検出され、上の読取り枠はホスファターゼIAの全長をコードしていることが確実に思われた。しかし、こうして得られたIAのアミノ酸配列には他の蛋白ホスファターゼとの間に相同性がまったく認められなかったので、上のpSTー11のcDNAを大腸菌に発現させ、活性を有するホスファターゼIAの生産を試みた。まずそのためのプラスミドを構築したが、これに10tacプロモータが用いられた。次いでこのプラスミドで大腸菌を形質変換させ、その大腸菌の抽出液を作って電気流動したところ、ホスファターゼIAの抗体を免疫反応し、かつホスファターゼIAと同サイズの蛋白バンドが認められた。さらにこのバンドが認められた抽出液には、ホスファターゼIAに特徴的なMg^<2+>依存性の蛋白ホスファターゼ活性が検出され、しかもバンドも活性もtacプロモーターを逆向きに挿入したプラスミドによっては生じなかった。以上から、pstー11がホスファターゼIAをコードしていることがまったく確実となった。次に以上のcDNAをプローブといて、ノーザンブロット法によりラット諸組織のmRNA量を測定したところ、骨格筋や精巣で肝や腎よりもはるかに高かった。活性測定では肝が骨格筋の2倍以上であるので、不一致は明らかに大きい。現在この理由を追求中である。