レタス種子発芽における光誘導GA_1の受容体の単離同定

1.受容体生合成時期を確認する目的で、まずタンパク質合成阻害剤の発芽に対する効果を調べた。その結果、転写段階の阻害剤(アクチノマイシンD、αアマニチン)は、発芽をほとんど阻害せず、翻訳段階の阻害剤(シクロヘキシイミド)が効果的に発芽を阻害した。そこで、同阻害剤を異なる濃度で、異なる時間パルス的に与え、発芽のタイムコースのずれを調べたが、阻害剤処理時間以上に発芽が遅れ、傾きも緩やかになった。このことは洗浄によっても阻害剤の影響が完全には除去できないことを意味しており、阻害剤処理による発芽の遅れから、受容体合成時期を決定することは無理のあることが明らかになった。2.アフィニティークロマトグラフィーを行なうために、ジベレリン(GA)をゲルに固定することを試みた。GAは高い生理作用を示しかつ入手が容易なGA_3を選び、7位の-COOHを介してEAH-セファロースチBと、3位あるいは13位の-OHを介してエポキシ活性化セファロース6Bと結合させた。その結果、それぞれゲル1ml当り0.3μM、0.1μMのGA_3が固定された。3.GAに対する感受性測定結果から、受容体が確実に存在していると考えられる。25℃暗所で4時間培養したレタス種子20gにPVPを加え、緑色安全光下で乳鉢と乳棒ですりつぶし、セファロースG25で低分子を除いた後、2で作成した2種類のゲルに吸着させた。これを、10^<-3>MGA_3で溶出し、得られたタンパク質画分をSDSページにかけてみた。その結果数本のバンドが認められたが、2種類のゲルでバンドパターンに差がなかった。この結果は、得られたバンドが非特異的な吸着によるものであることを示唆している。さらに、どちらかのゲルに特異的なバンドを得るべく、溶出条件等を検討したが、残念ながら現在に至るまで明確な差は得られていない。

1.受容体生合成時期を確認する目的で、まずタンパク質合成阻害剤の発芽に対する効果を調べた。その結果、転写段階の阻害剤(アクチノマイシンD、αアマニチン)は、発芽をほとんど阻害せず、翻訳段階の阻害剤(シクロヘキシイミド)が効果的に発芽を阻害した。そこで、同阻害剤を異なる濃度で、異なる時間パルス的に与え、発芽のタイムコースのずれを調べたが、阻害剤処理時間以上に発芽が遅れ、傾きも緩やかになった。このことは洗浄によっても阻害剤の影響が完全には除去できないことを意味しており、阻害剤処理による発芽の遅れから、受容体合成時期を決定することは無理のあることが明らかになった。2.アフィニティークロマトグラフィーを行なうために、ジベレリン(GA)をゲルに固定することを試みた。GAは高い生理作用を示しかつ入手が容易なGA_3を選び、7位の-COOHを介してEAH-セファロースチBと、3位あるいは13位の-OHを介してエポキシ活性化セファロース6Bと結合させた。その結果、それぞれゲル1ml当り0.3μM、0.1μMのGA_3が固定された。3.GAに対する感受性測定結果から、受容体が確実に存在していると考えられる。25℃暗所で4時間培養したレタス種子20gにPVPを加え、緑色安全光下で乳鉢と乳棒ですりつぶし、セファロースG25で低分子を除いた後、2で作成した2種類のゲルに吸着させた。これを、10^<-3>MGA_3で溶出し、得られたタンパク質画分をSDSページにかけてみた。その結果数本のバンドが認められたが、2種類のゲルでバンドパターンに差がなかった。この結果は、得られたバンドが非特異的な吸着によるものであることを示唆している。さらに、どちらかのゲルに特異的なバンドを得るべく、溶出条件等を検討したが、残念ながら現在に至るまで明確な差は得られていない。