フィトクロム光変換に伴うアポ蛋白質の立体構造変化の単クローン坑体を用いた解析

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1.測定原理及び装置の開発。Prを角度0度の偏光で励起し、Pfrを誘導した場合、Pr-Pfr間の遷移能率方向がω異なるとすると、励起光と平行並びに直行方向のPfrの吸光度比は以下の関係にある(浜口 私信)。【A_(9θ)】/【A_θ】=(2-【COS^2】ω)/(1-【2COS^2】ω)そこで、分光光度計の測定光路に偏光角を90度変えられる偏光板を設置し、4種類の単クーロン抗体でセファロースに固定したPrに赤色偏光を異なる時間照射し、励起偏光と平行並びに直行する方向でのPfrの730nmにおける吸光度比を測定した。つぎに、この【A_(9θ)】/【A_θ】の値から、予め計算しておいた変換表を用いてωを求めた。2.異なる単クローン抗体で固定した場合の遷移能率変化。フィトクロムの発色団の結合部位に比較的近い部分に識別域を持つと考えられる単クローン抗体mAP-6(Nagatani et al.1984)でフィトクロムを固定した場合、吸光度比は0.83となり、遷移能率は約49度異なる。発色団結合部位とC端の中間に識別域を持つと考えられるmAP-1では、吸光度比は0.98で54度,C端に近いmAP-5では1.00で55度,逆にN端側のmAP-10では1.01で55度となった。これらの結果は、発色団の軸を基準にしてアポタンパク質の構造を考えた場合、PrからPfrへの光変換に伴い、タンパク質は約50度程変化し、かつタンパク質内部では場所による相対位置の変化は数度程度にしかすぎないことを示唆するようにも見えるが、mAP-1,5,10の示す吸光度比はいずれも1に近く、フィトクロムはセファロースにくっついてはいても、歳差運動等は完全には止まって居なかった可能性も考えられる。従来の研究においても、抗体で固定した場合、フィトクロム分子の自由運動がどの程度抑えられていたかの検討は全くなされておらず、従来言われているPr-Pfr間で約30度という値も、今後検討し直すことが、必要と思われる。