ポリオーマビールス遺伝子を用いた心筋クローン細胞作成の試み

尝试利用多瘤病毒基因创建心肌克隆细胞

• 批准号: 63570384
• 负责人: 吉良 有二
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1988
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1988 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-63570384/
• 关键词: 心筋クローン細胞; ポリオーマビールス; 遺伝子導入

ウイスターイマミチ系雌妊娠ラット(10日令)の胎児より心臓を摘出した。この胎児期の心臓は心室、心房の完全な形成には至らず、軽度のくびれを持つ管状構造で30〜40/分の拍動を示した。この心臓の将来心室になる部分を高倍率の実体顕微鏡下に分離回収し、低濃度トリプシン(0.04%)を含むCaフリ燐酸緩衝液中にて消化後、心室筋細胞を得た。心筋細胞は10%FCS入りMEM培地に培養皿(3cm径)当り5×10^2個の濃度で培養した。ポリオーマビールス遺伝子の抽出は、PBR322プラスミドに組み込まれたPPY_1、PLT_1、PLTtsa、PLT_<214>、を持つE.coliを増殖後、セシウムクロライド法により分離抽出した。抽出されたDNA量はE.coli2×10^6コ当り1ugで、アガロースゲル電気泳動にてバンドを確認した。ポリオーマビールス遺伝子導入は、DNA-CaPO_4共沈澱法により、培養開始1時間後、24時間後の心室筋細胞に対し試みた。導入に用いたDNA量は各遺伝子とも約300〜400ng/培養皿を加えた。培養液のみで培養した心筋細胞は培養48〜72時間後に円形より紡錘形に変形し、拍動を認めた。10〜14日目には接着しあった細胞群が同期して収縮した。DNA-CaPO_4共沈澱物を培養開始1時間目の細胞に24時間添加した場合、細胞は拍動性、分裂能を失い失活した。培養開始24時間目の細胞に24時間添加した場合、細胞は一部分拍動性を保ち得たが、形態は無添加群と同様であった。そこで培養開始1時間目の細胞に4時間添加後、EGTA液で洗浄後経過を観察した所、やや丸みをおびた生存した細胞が得られたが、次第に経時的に形態は無添加群と類似したものとなり、分裂能も失った。以上より心筋細胞に遺伝子導入を行いクロン細胞を作成するには、胎生10日目より早期、胎児心筋を用いること、DNA-CaPO_4共沈澱法はあまり適切な方法でない事が明かとなった。又グリセロールとヨク法も成功しななったため、電気ショック法を今後試みる予定である。

Please tell me that the pregnant woman is pregnant (10 days) and the heart is out of the womb. During the fetal period, the ventricle and atrium of the fetal heart were completely formed from the heart to the atrium, and the temperature was in the shape of a tube for 3040 minutes. In the future heart, the heart is divided into two parts: high rate, low temperature, low temperature (0.04%) and Ca (0.04%). After digestion, the cells of the ventricular tendons are isolated. The heart cell 10%FCS enters the MEM petri dish (3cm diameter) when it is 5 × 10 ^ 2 degrees centigrade. After reproducing, the PBR322, PLTtsa, PLT_<214>, PPY _ 1, PLT_1, PLTtsa, PPY, PPY, PPY Pull out the DNA measurement E.coli2 × 10 ^ 6 to make sure that the 1ug is good, and that the swimming activity is not clear. After 1 and 24 hours after the start of the training, the ventricular muscle cells were tested by the DNA-CaPO_4 co-sedimentation test, which was used to test the heart rate. Add the amount of DNA into the 300~400ng/ petri dish and add the amount of DNA. After 48 and 72 hours of incubation, the cells of the heart were incubated in the shape of the heart, the shape and the shape of the heart. At the end of the 10th and 14th day, the population of the cell was divided into two groups. At the beginning of DNA-CaPO_4 co-precipitation culture, the cell cycle, cell beat, mitotic energy inactivation and inactivation were added within 24 hours. At the beginning of the training program, 24 hours after the beginning of the training program, a combination is added in the 24-hour program, a part of the cell is protected against sexual activity, and a group of people are added in the same period of time. One hour after the start of the training program, four hours after the addition of the target cell, the EGTA solution was washed through the inspection center, the pill was used to test the survival rate of the cell, and at the second time, the shape of the cell was similar to that of the cell, and the splitting energy was lost. In the early stage of 10 days of birth, the heart of the fetus is in the early stage, and the DNA-CaPO_4 co-sedimentation method is used. In addition, the law has been successfully approved, and the law has been tried to determine the date of the election.