ラット肝臓からの肝細胞増殖因子の精製

从大鼠肝脏中纯化肝细胞生长因子

• 批准号: 01570158
• 负责人: 冨田 優美子
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: The University of Tokushima
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1989
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1989 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01570158/
• 关键词: 肝細胞増殖因子; 精製; 初代培養肝細胞; DNA合成; 肝臓; ラット

我々は既に新しい肝細胞の強力な増殖因子である肝細胞増殖因子(HGF)が高濃度にラット血小板中に存在することを見つけ単一標品にまで純化した。この因子は分子量69Kと34Kから成る二量体の熱および酸に不安定な蛋白性の物質である。その後、ラットにおけるHGFの臓器分布を初代培養肝細胞のDNA合成を促進する活性を測定することにより検討したところ肝臓に多くさん含まれていることがわかった。そこで肝臓からのHGFの精製を試みた。まず80gの肝臓に2容量の0.25Mショ糖を含むPH8.5の緩衝液を加えホモジネ-ト後、105000×g、1時間の遠心で得た抽出液をS-Sepharoseカラムにかけると大部分の蛋白は非吸着画分に溶出した。その後、0.15Mから1Mの塩濃度勾配で溶出すると0.68MでHGFが溶出した。次にこのHGF活性があった画分をHeparin-Sepharose-CL-6Bカラムにかけ0.3Mから2Mの塩濃度で溶出すると1M付近にHGF活性がみられた。さらにHGF活性のあった画分をMono-S,FPLCカラムで前記のS-Sepharoseカラムと同じ条件で再クロマトグラフイ-を行った。この段階のHGFはS-Sepharoseカラムにかけた直後のHGFに比べて41倍精製されており回収率は20.5%であった。さらに、このHGFを逆相カラム、RP-304 HPLCにかけ0.1% トリフルオロ酢酸存在下、アセトニトリル40%から50%の濃度で溶出すると42%でHGFが溶出した。肝臓由来のHGFの各種クロマト上の挙動および蛋白化学的、生物学的特性は血小板由来のHGFと全く同じだった。しかし、肝由来のHGFは血小板由来ののHGFと違って逆相クロマト後でも単一標本品にはなっていなかった。今後、Hydroxylapatite,Affi-Gel Blue等のクロマトを行い完全に純化し、分子量およびサブユニットの構成、種々の性質を調べ血小板由来のHGFと同じであるかどうか明らかにしたい。

We found that hepatocyte growth factor (HGF), a potent growth factor for hepatocytes, was present in high concentrations in platelets and purified from a standard sample. The molecular weight of this factor is 69K and 34K, and the heat and acid of the two substances are unstable. The distribution of HGF in primary cultured hepatocytes was determined by DNA synthesis assay. HGF is refined and refined. 80g of liver extract 2 volumes of 0.25 M glucose buffer solution containing pH 8.5 was added to the solution, 105000×g, 1 time to obtain the extract solution of S-Sepharose. Most of the proteins were dissolved in non-sorbed fractions. HGF was dissolved from 0.68M to 0.15M at concentrations ranging from 0.15M to 1M. The HGF activity was determined by HPLC. The concentration of Heparin-Sepharose-CL-6B was 0.3M, 2M and 1M. HGF activity was determined by Mono-S,FPLC, and the S-Sepharose was determined by the same conditions. The HGF of this stage is 41 times more refined than that of S-Sepharose, and the recovery rate is 20.5%. In addition, HGF was dissolved in RP-304 HPLC at concentrations ranging from 40% to 50% in the presence of 0.1% hydrochloric acid. The origin of HGF and its biological characteristics HGF from the liver, HGF from the platelets, HGF from the liver, HGF from the platelets, HGF from the platelets. In the future, Hydroxylapatite,Affi-Gel Blue and others will be completely purified, molecular weight, composition and species properties will be adjusted, and the origin of HGF will be determined.