イモリにおけるレンズの再生を虹彩上縁部に限定する分子の解析

限制蝾螈晶状体再生至虹膜上缘的分子分析

• 批准号: 02640573
• 负责人: 阿形 清和
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Okazaki National Research Institutes
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02640573/
• 关键词: イモリ; 再生; レンズ; 色素上皮; モノクロ-ナル抗体; 糖タンパク質

(1)2NIー36抗原が認識する抗原の精製:これまでに、この抗原分子はウエスタンブロットによって80kD以上の不溶性タンパク質として検出されていたが、その生化学的実体は不明瞭のままであった。そこで、我々はイモリからこの抗原分子を精製し生化学的性質を明らかにすることを計画した。現在、以下に示すような精製方法を確立し、この抗原分子の生化学的性質を解析中である。我々の確立した精製方法は(1)イモリから不溶性膜分画を調整した後、TritonXー100によって抗原分子を可溶化する。(2)可溶化された抗原分子をDEAEーSepharose chromatography及びRCA120Ag arose chromatographyにかける。(3)2NIー36抗原を固定化したSepharose chromatographyにかける。(4)透析後、TritonXー100を除去する。(5)超遠心後沈澱した抗原分子を50%アセトニトリルで可溶化した後、粉末化する。この方法で抗原分子をほぼ精製できたと思われる。この精製標品のウエスタンブロットにより、この抗原分子は分子量80kD、100kD、120kD、180kDの大きさをもつ大溶性糖タンパク質であることが明かとなった。(2)抗原分子の遺伝子のクロ-ニング:精製標品を用いて作成したポリクロ-ナル抗体を使用して、λgt11発現ベクタ-で作製したイモリcDNAライブラリ-をスクリ-ニングしたところ、3個のポジティブクロ-ンが得られた。現在各クロ-ンの塩基配列決定の作業が進行中である。(3)生体内分布と正常発生における発現時期の解析:免疫組織化学的手法を用いてこの抗原分子の生体内分布を調べたところ、この抗原分子は色素上皮細胞特異的ではなく真皮、血管、中腎など各組織を広く分布していることが判明した。また、同様な手法を用いて発生段階における発現時期を調べた結果、眼球内では色素上皮細胞の分化に伴って初めて発現することも明かとなった。そのほか血管の形成とともに発現することもわかった。

（1）由2NI-36抗原识别的抗原纯化：到目前为止，该抗原分子被Western blot检测到80 kd或更多的不溶性蛋白，但其生化实体尚不清楚。因此，我们计划从Newt纯化该抗原分子以揭示其生化特性。目前，已经建立了以下纯化方法，并正在分析该抗原分子的生化特性。我们已建立的纯化方法是（1）在准备了NEWT的不溶性膜分数后，抗原分子用Tritonx-100溶解。 （2）溶解化的抗原分子接受DEAE-Sepharose色谱法和RCA120AG的作用。 （3）用固定的2NI-36抗原代替Sepharose色谱法。 （4）透析后，删除Tritonx-100。 （5）超速离心后已沉淀的抗原分子用50％乙腈溶解，然后转化为粉末。看来该方法几乎可以纯化抗原分子。这种纯化的制剂的蛋白质印迹表明，抗原分子是一种大黄糖糖蛋白，分子量为80KD，100KD，120KD和180KD。 （2）抗原分子基因的克隆：使用使用纯化的制剂产生的多克隆抗体筛选了用λgt11表达载体创建的NEWT cDNA库，并获得了三个阳性克隆。当前，正在进行对克隆进行序列的工作。 （3）分析正常发育中生物分布和表达的时间：当我们使用免疫组织化学技术研究了该抗原分子的生物分布时，发现该抗原分子并非特定于色素上皮细胞，而是广泛分布在诸如Dermis，Dermis，Dermis，Bloods，血管，血管，血管和Mesdonia和Mesdonia和Mesdonia中。此外，在使用类似技术在发育阶段检查表达时机时，发现它仅在分化色素上皮细胞时才出现在眼中。还发现它被揭示为形成的血管形成。