ブラインシュリンプのノ-プリウス幼生からのトレハラ-ゼとセロビア-ゼの同時調製

丰年虾无节幼体海藻糖酶和纤维二糖酶的同时制备

• 批准号: 02640572
• 负责人: 南部 滋郎
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: University Occupational and Environmental Health, School of Nursing and Medical Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02640572/
• 关键词: トレハラ-ゼ; セロビア-ゼ; βーグルコシダ-ゼ; ブラインシュリンプ; アルテミア; ノ-プリウス; トレハロ-ス; セロビオ-ス

1.トレハラ-ゼの精製.ノ-プリウス幼生のホモジネ-トよりポストミトコンドリア画分を得,これをアセトン処理,DEAEーSepharose CLー6Bクロマトグラフィ-,ConAーSepharose 4Bクロマトグラフィ-した後,Polyー(A)ーSepharose 4Bクロマトグラフィ-を新たに導入した。低イオン強度で酵素を吸着させ,100mMイミダゾ-ル-塩酸にて溶出した。活性画分をTSKG3000SWで3回ゲルろ過HPLCI酵素を精製した。Poly(A)Sepharose 4Bカラムは,従来クロマトフォ-カシングしていたステップに代り導入されたものである。これにより純品の酵素が,安定的に得られた。2.セロビア-ゼの精製.ConAーSepharoseクロマトグラフィ-まではトレハラ-ゼと同一条件で行い,この後クロマトフォ-カシングし,次にTSKG3000SWにて3回ゲルろ過HPLCを行うことにより,安定で多量の酵素が手に入った。3.トレハラ-ゼの性状分析:粗標品によって得ていたデ-タを純品にてやり直す予定である(純品が得られたのは2月末であった)。4.セロビア-ゼの性状分析:新たに(1)熱安定性の解析,(2)セロオリゴ糖に対する基質特異性のチェック,(3)イミダゾ-ルが阻害効果を持つことの確認,(4)アミノ酸組成分析,(5)N末端アミノ酸がブロックされていた。(6)アシルアミノ酸遊離酵素処理とアミノ酸配列分析により,N末端より二番目のアミノ酸がセリン,三番目がグリシンと推定した。詳しいことは分析中である。5.両酵素に対する抗体の作製は,mg以上の純品が必要なので現在準備中である。6.抗体を用いて,ブラインシュリンプの発生過程における酵素の発現の推移や幼生内酵素分布の検索を今後行いたい。7.得られた純品の酵素の部分アミノ酸配列の決定を行い,CDNAのクロ-ニングをめざしたい。(平成3年度の科研費に申請中)

1. ト レ ハ ラ - ゼ の refined. ノ - プ リ ウ ス larval の ホ モ ジ ネ - ト よ り ポ ス ト ミ ト コ ン ド リ ア を draw points, こ れ を ア セ ト ン 処, DEAE ー Sepharose CL ー 6 b ク ロ マ ト グ ラ フ ィ -- ConA ー Sepharose 4 b ク ロ マ ト グ ラ フ ィ - し た, Poly real ー (A) ー Sepharose 4 b ク ロ マ ト グ ラ フ ィ を new た に import し た. Low <s:1> <s:1> intensity で enzyme を adsorbs させ,100mM <s:1> ダゾ- た - salic acid にて dissolves た た. The active fractions were をTSKG3000SWで3 times ゲ ろ ろ and then refined by HPLCI enzyme を た. Poly real Sepharose 4 b (A) カ ラ ム は, 従 to ク ロ マ ト フ ォ - カ シ ン グ し て い た ス テ ッ プ に generation り import さ れ た も の で あ る. <s:1> れによ が pure calythase が, stable に られた. 2. Youdaoplaceholder0 -ゼ seal refining. ConA ー Sepharose ク ロ マ ト グ ラ フ ィ - ま で は ト レ ハ ラ - ゼ と で い, same conditions こ の after ク ロ マ ト フ ォ - カ シ ン グ し, time に TSKG3000SW に て 3 back ゲ ル ろ line through HPLC を う こ と に よ り, settle で が hand に の enzyme into the abundant っ た. 3. ト レ ハ ラ - ゼ の character analysis: coarse standard product に よ っ て have て い た デ - タ を tasted に て や り straight す designated で あ る (tasted が ら れ た の は late February で あ っ た). 4. セ ロ ビ ア - ゼ の character analysis: new た に (1) thermal stability の parsing, (2) セ ロ オ リ ゴ sugar に す seaborne る substrate specificity の チ ェ ッ ク, (3) イ ミ ダ ゾ - ル が resistance against unseen fruit を hold つ こ と の confirmed, (4) ア ミ ノ acid composition analysis, and (5) N terminal ア ミ ノ acid が ブ ロ ッ ク さ れ て い た. (6) ア シ ル ア ミ ノ acid free enzyme 処 Richard と ア ミ ノ acid with column analysis に よ り, N terminal よ り second leg mesh の ア ミ ノ acid が セ リ ン, three transgressions mesh が グ リ シ ン と presumption し た. For details, please refer to the analysis of である と と である. 5. Two enzymes に are used to prepare する antibody samples. The pure sample of <s:1> with a concentration of mg or more is が necessary な で で currently in preparation である. 6. Antibody を with い て, ブ ラ イ ン シ ュ リ ン プ の 発 birth process に お け る enzyme の 発 の now goes on や distribution of enzymes in the larval の 検 line cable を future い た い. 7. To obtain the られた pure calycoenzyme, the <s:1> part of ア and ノ acids are arranged to determine the を row グをめざ, and the CDNA cdna <s:1> ロ-ニ ニ グをめざ た た た た た た. (Application for the Heisei 3 academic Year scientific research fee に in progress)

项目成果

Z.Nambu and F.NambuーAkiyama: "Developmental changes in trehalase and cellobiase activities of Artemia salinaーEffects of cycloheximide and actinomycin D." Zool.Sci.,. 7. 1108 (1990)

Z.Nambu 和 F.Nambu-Akiyama：“卤虫海藻糖酶和纤维二糖酶活性的发育变化 - 放线菌酮和放线菌素 D 的影响。Sci. 7. 1108 (1990)”

南部 滋郎,南部 文子(秋山 文子): "ブラインシュリンプのノ-プリウス幼生の二糖分解酵素 (I)α,αートレハラ-ゼの精製とその性質" 生化学. 62. 764 (1990)

Shigeo Nambu、Fumiko Nambu（Ayako Akiyama）：“丰年虾无节幼体幼虫中二糖降解酶 (I)α,α-海藻糖酶的纯化和特性”生物化学 62. 764 (1990)。

南部 文子(秋山 文子),南部 滋郎: "ブラインシュリンプのノ-プリウス幼生の二糖分解酵素 (II)セロビア-ゼの精製とその性質" 生化学. 62. 764 (1990)

Ayako Nambu (Ayako Akiyama)、Shigero Nambu：“丰年虾无节幼体的二糖降解酶 (II) 纤维二糖酶的纯化和特性”生物化学 62. 764 (1990)。