ヒトDNAミスマッチ修復機構の解明とその発癌への関与

ヒト葉酸脱水素酵素dihydrofolate reductase遺伝子の89bp上流に存在するDNA mismatch修復酵素遺伝子MRP1の性質を明らかにするため、およびこの蛋白質に対するモノクロ-ナル抗体を作製するために、Baculovirus systemを用いてこの蛋白質の大量発現を行った。MRP1遺伝子の全体あるいは5'側860ntを除去したDNA断片を、transfer vectorであるpVL941のpolyhedrin promoter下に挿入し、野生型AcMNPVと共にSf9細胞に導入して、MRP1蛋白質を発現可能なrecombinant virusを作製した。このvirusをSf9細胞に感染させると、大量のMRP1蛋白質の発現が核に認められた。従ってMRP1蛋白質は核に局在する蛋白質であることが明かとなった。感染細胞からのMRP1蛋白質の抽出に関しては、一般の核蛋白質の抽出方法では抽出できず困難を極めたが、4M塩酸グアニジンの使用により可溶化できることが判明し、鋭意精製を行っている。精製が遅れたため、モノクロ-ナル抗体の作成は未だできていない。またMRP1蛋白質と各種のミスマッチを有するheteroduplex DNAとの結合能を調べるためにアプライドバイオシステムズ社製DNAシンセサイザ-model 381Aを用いてオリゴヌクレオチドを合成した。一方、DNA mismatch修復機構と発がんとの関係を明らかにするため、ヒトMRP1のmouse homologueをRTーPCR法を用いて増幅・クロ-ニングし、ATG翻訳開始コドンを含む298nt.部分のantisense RNAを発現するベクタ-を作製した。これを燐酸カルシウム法にてNIH3T3細胞内に導入し、focus assay及びin vivo selection assayを行ったところ、それぞれfocus並びに腫瘤の形成をみたことから、DNA mismatch修復機構の障害が細胞のがん化の一つの原因になりうると考えられた。現在これらの細胞におけるがん遺伝子の活性化、ならびにがん抑制遺伝子の不活性化の有無につきPCRーSSCP法を用いて検討している。

ヒト葉酸脱水素酵素dihydrofolate reductase遺伝子の89bp上流に存在するDNA mismatch修復酵素遺伝子MRP1の性質を明らかにするため、およびこの蛋白質に対するモノクロ-ナル抗体を作製するために、Baculovirus systemを用いてこの蛋白質の大量発現を行った。MRP1遺伝子の全体あるいは5'側860ntを除去したDNA断片を、transfer vectorであるpVL941のpolyhedrin promoter下に挿入し、野生型AcMNPVと共にSf9細胞に導入して、MRP1蛋白質を発現可能なrecombinant virusを作製した。このvirusをSf9細胞に感染させると、大量のMRP1蛋白質の発現が核に認められた。従ってMRP1蛋白質は核に局在する蛋白質であることが明かとなった。感染細胞からのMRP1蛋白質の抽出に関しては、一般の核蛋白質の抽出方法では抽出できず困難を極めたが、4M塩酸グアニジンの使用により可溶化できることが判明し、鋭意精製を行っている。精製が遅れたため、モノクロ-ナル抗体の作成は未だできていない。またMRP1蛋白質と各種のミスマッチを有するheteroduplex DNAとの結合能を調べるためにアプライドバイオシステムズ社製DNAシンセサイザ-model 381Aを用いてオリゴヌクレオチドを合成した。一方、DNA mismatch修復機構と発がんとの関係を明らかにするため、ヒトMRP1のmouse homologueをRTーPCR法を用いて増幅・クロ-ニングし、ATG翻訳開始コドンを含む298nt.部分のantisense RNAを発現するベクタ-を作製した。これを燐酸カルシウム法にてNIH3T3細胞内に導入し、focus assay及びin vivo selection assayを行ったところ、それぞれfocus並びに腫瘤の形成をみたことから、DNA mismatch修復機構の障害が細胞のがん化の一つの原因になりうると考えられた。現在これらの細胞におけるがん遺伝子の活性化、ならびにがん抑制遺伝子の不活性化の有無につきPCRーSSCP法を用いて検討している。