ヒトDNAミスマッチ修復機構の解明とその発癌への関与

阐明人类DNA错配修复机制及其与癌发生的关系

• 批准号: 03152126
• 负责人: 藤井 裕之
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Nippon Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Cancer Research
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03152126/
• 关键词: DNAミスマッチ; DNA修復; バキュロウイルス; アンチセンスRNA; PCRーSSCP法

ヒト葉酸脱水素酵素dihydrofolate reductase遺伝子の89bp上流に存在するDNA mismatch修復酵素遺伝子MRP1の性質を明らかにするため、およびこの蛋白質に対するモノクロ-ナル抗体を作製するために、Baculovirus systemを用いてこの蛋白質の大量発現を行った。MRP1遺伝子の全体あるいは5'側860ntを除去したDNA断片を、transfer vectorであるpVL941のpolyhedrin promoter下に挿入し、野生型AcMNPVと共にSf9細胞に導入して、MRP1蛋白質を発現可能なrecombinant virusを作製した。このvirusをSf9細胞に感染させると、大量のMRP1蛋白質の発現が核に認められた。従ってMRP1蛋白質は核に局在する蛋白質であることが明かとなった。感染細胞からのMRP1蛋白質の抽出に関しては、一般の核蛋白質の抽出方法では抽出できず困難を極めたが、4M塩酸グアニジンの使用により可溶化できることが判明し、鋭意精製を行っている。精製が遅れたため、モノクロ-ナル抗体の作成は未だできていない。またMRP1蛋白質と各種のミスマッチを有するheteroduplex DNAとの結合能を調べるためにアプライドバイオシステムズ社製DNAシンセサイザ-model 381Aを用いてオリゴヌクレオチドを合成した。一方、DNA mismatch修復機構と発がんとの関係を明らかにするため、ヒトMRP1のmouse homologueをRTーPCR法を用いて増幅・クロ-ニングし、ATG翻訳開始コドンを含む298nt.部分のantisense RNAを発現するベクタ-を作製した。これを燐酸カルシウム法にてNIH3T3細胞内に導入し、focus assay及びin vivo selection assayを行ったところ、それぞれfocus並びに腫瘤の形成をみたことから、DNA mismatch修復機構の障害が細胞のがん化の一つの原因になりうると考えられた。現在これらの細胞におけるがん遺伝子の活性化、ならびにがん抑制遺伝子の不活性化の有無につきPCRーSSCP法を用いて検討している。

Youdaoplaceholder3 DNA is present in に above 89bp of the 伝 seed of the ヒト dihydrofolate reductase enzyme Mismatch repair enzyme heritage 伝 son MRP1 の nature を Ming ら か に す る た め, お よ び こ の protein に す seaborne る モ ノ ク ロ - ナ ル antibody を cropping す る た め に, Baculovirus system を い て こ の protein の a lot 発 line now を っ た. All of the 伝 sub-samples of MRP1 ある the <s:1> <s:1> side <e:1> of the 5' side 860ntを removed the <s:1> たDNA fragment を and transferred the vectorであるpVL941 polyhedrin Under the promoter に scions into し, wild type AcMNPV と altogether に Sf9 cells に import し て, MRP1 protein を 発 may now な recombinant virus get を cropping し た. <s:1> virusをSf9 cells に infect させると, and a large amount of <s:1> MRP1 protein <s:1> shows が nuclear に recognition められた. The に nuclear に of the 従ってMRP1 protein is located in the する protein である とが とが and となった. Infected cells か ら の MRP1 protein の spare に masato し て は, general の の nuclear protein extraction methods で は spare で き ず difficult を extremely め た が, 4 m salt acid グ ア ニ ジ ン の use に よ り solubilization で き る こ と が.at し line, refined を っ て い る. Refined が遅れたため, モノ ロ ロ-ナ て antibody <s:1> to モノ unだ で て て な な な な モノ. ま た MRP1 protein と various の ミ ス マ ッ チ を have す る heteroduplex DNA と の binding energy を adjustable べ る た め に ア プ ラ イ ド バ イ オ シ ス テ ム ズ club system of DNA シ ン セ サ イ ザ - model 381 a を use い て オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を synthetic し た. Side, DNA mismatch repair agency と 発 が ん と の masato を and Ming ら か に す る た め, ヒ ト MRP1 の mouse 'を RT PCR method ー を with い て rights, picture ク ロ - ニ ン グ し, ATG 訳 start コ ド ン を む 298 nt. Some of the <s:1> antisense Rnas を are produced in するベ タ タ-を to make <s:1> た. こ れ を 燐 acid カ ル シ ウ ム method に て NIH3T3 cells に import し, focus and び assay in vivo selection assay を line っ た と こ ろ, そ れ ぞ れ focus and び に tumor の form を み た こ と か ら, DNA The mismatch repair mechanism is blocked by が cell がん がん transformation <e:1>. The cause is にな うると うると examination えられた. Now こ れ ら の cells に お け る が ん heritage 伝 の activeness, な ら び に が ん inhibit heritage 伝 son の activeness の have not に つ ー き PCR SSCP method を with い て beg し 検 て い る.