大気汚染疫学と動物曝露実験の整合性に関する研究

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これまでに窒素酸化物曝露ラットの気管洗浄液中の蛋白質を一次元および二次元ゲル電気泳動により分析し、窒素酸化物曝露にともなって増加する複数の蛋白質の存在を明らかにした。その中で分子量48キロダルトン、等電点約4.0の糖蛋白質に焦点を合わせてその精製を試みた。目的蛋白質が糖蛋白質であることが予想されたので、ビオチン化レクチンをプローブとして目的蛋白質に反応するレクチンの検索を行った結果、コンカナバリンA、インゲンマメレクチンE4、およびヒママメレクチンIが特異的に目的蛋白質に結合することが判明した。そこで、コンカナバリンAをアガロースビーズに固定したカラムを用いて精製を試みた。窒素酸化物曝露ラット気管洗浄液をこのカラムに重層し、よく洗浄した後、0.2モルのメチルα-Dグルコシドにより溶出したところ、溶出画分に目的蛋白質と同一の分子量を持つ蛋白質を検出することができたが、この画分にも目的蛋白質以外の蛋白質が混入していた。これはレクチンブロッティングの結果と良く一致していた。目的蛋白質をコンカナバリンA結合画分よりさらに精製する目的で、インゲンマメレクチンE4をアガロースビーズに固定したものをカラムに充填したものを用いた。予備実験として少量のコンカナバリンA結合画分をこのカラムに重層し、よく洗浄した後、0.2モルのほう酸カリウムにより溶出したところ、少量の蛋白質が溶出された。スケールアップして同様な実験を行い、目的蛋白質の精製を試みたが十分量の蛋白質を得るには到らなかった。結論としては、精製蛋白質のアミノ末端よりアミノ酸配列を決定し、これを元にして、(1)合成ペプチッドを作成するか、あるいは(2)アミノ酸配列をもとにして蛋白質のcDNAをクローニングしリコンビナント蛋白質を構築し、これらにより免疫することによって、モノクローナル抗体を作成することが妥当であることが判った。