ラット初代培養中枢神経細胞に対する生存因子,生存抑制因子の同定

原代培养大鼠中枢神经细胞存活因子和存活抑制因子的鉴定

• 批准号: 03670570
• 负责人: 橋本 泰道
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Kyoto Prefectural University of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03670570/
• 关键词: 神経細胞生存因子; 神経細胞生存抑制因子

・ラット脳の神経細胞の初代培養系の確立:妊娠16日のラットから、胎児脳を無菌的に取り出し、トリプシン処理で単一細胞とし、あらかじめpolyーDーlysineでcoatingしたwellに播種した。無血清培地として、EagleMEM+HamF_<12>(1:1)にinsulin;5.0μg/ml,transferrin;100.0μg/ml,putrescine;16.1μg/ml,selenium;5.19ng/ml,progesterone;6.29ng/ml,βーestradiol;0.27pg/ml,dexamethasone;10.0ng/ml,T_3;200ng/mlを添加したchemically defined medium(CDM)を用いた。培養11日目に固定し、neuronーspecific MAP_2で染色したところ、約90%以上がニュ-ロンであることが確認された。また、同じ系において、ヒスタミン刺激により細胞内のcAMP濃度の上昇が確認された。以上に関しては京都府立医科大学雑誌に発表した。・ラット睾丸からの神経細胞生存因子の精製:Wistar系雄性ラット(体重約250g)を断頭致死せしめ、すみやかに睾丸を摘出し、2倍量の水でホモジネ-トとし、10,000xg,60分遠沈し、上清を、限外濾過装置(SAMPLATECセパコンカセット8751BA,MASTERFLEXモ-タ-・ポンプ付き)で、分子量1,000以下、1,000から10,000、および10,000以上の分画に分けた。これらの分画の一定量をCDMに加えてラット胎児脳の神経細胞を培養し、5日後に残存細胞の数を計測した。分子量1,000以下の分画を加えたwellでは、神経細胞の生存促進、抑制のいずれの効果も認められなかった。分子量10,000以上の分画を加えたwellでは、神経細胞が融解壊死をおこした。分子量1,000から10,000の分画を加えたwellではcontrolのwellに比較し、残存細胞の数の有意な増加が認められた。この分画の生存因子を同定するため、大量に凍結保存したラット睾丸から同分画を精製したところ、神経細胞生存促進作用は消失していた。現在、同分画の抽出・精製過程を検討中である。

·Establishment of primary culture system of cultured neurons: sterile extraction of fetal cells on day 16 of pregnancy, treatment of single cells, coating of poly-D-lysine and seeding. Serum-free medium, EagleMEM+HamF_<12>(1:1), insulin; 5.0μg/ml,transferrin; 100.0μg/ml,putrescine; 16.1μg/ml,selenium; 5.19ng/ml,progesterone; 6.29ng/ml,βーestradiol; 0.27pg/ml,dexamethasone; 10.0ng/ml,T_3; 200ng/ml is added to chemically defined medium(CDM). After 11 days of culture, the protein was fixed and neuron-specific MAP_2 staining was confirmed by more than 90% of the protein. The increase of intracellular cAMP concentration was confirmed by the stimulation of the same system. The above is related to the Kyoto Prefectural Medical University's ambition. The purification of testicular neuronal survival factor:Wistar male (weight about 250g), decapitation, testicular extraction, twice the amount of water, 10,000 xg,60 minutes, supernatant, external filtration device (SAMPLATEC 8751BA,MASTERFLEX 8751BA), molecular weight less than 1,000, molecular weight less than 1,000, molecular weight more than 10,000. After 5 days of culture, the number of remaining cells was measured. Molecular weight of 1,000 or less is increased, and the survival of neurons is promoted and inhibited. Molecular weight of 10,000 or more points to increase the well, brain cells to melt to death. The molecular weight of 1,000 to 10,000 was increased and the number of remaining cells was increased. The survival factors of these cells were determined by freezing and preserving them in large quantities, and the survival promoting effects of these cells disappeared. Now, the same drawing extraction and refinement process is discussed.

项目成果

長谷川 武史: "ヒドロキシヒスタミンの生成とヒスタミン受容体に対する作用に関する研究" 京都府立医科大学雑誌. 100. 819-830 (1991)

长谷川武：“羟基组胺的产生及其对组胺受体的作用的研究”京都府立医科大学学报100。819-830（1991）。