特異な機能を持つ金属プロテア-ゼの分子構造と機能に関する研究

セラチア菌が生産する亜鉛を活性部位にもち,分子量51,000セラチアプロテア-ゼの分子構造と機能に関する研究の基礎として,以下の研究を行った。高分解能でのX線構造解析を行うために,結晶性が良く,0.5mm程度の大きな結晶がコンスタントに得られる条件の検討を行った。結晶化の直前にSephacryl Sー100を用いたカラムクロマトグラフィ-で精製した2%セラチアプロテア-ゼ,2% PEG6000,50mMりん酸緩衝液(pH6.0)を含む容液50μlを50mmりん酸緩衝液を含む25%硫酸アンモニウム容液(pH6.0)で1週間透析した後,硫酸アンモニウムの濃度を28%に上げることにより,約3週間で得られる結晶は実験室レベルX線回折装置でも2.0Å分解能の回折強度が得られることを確認し,大阪大学蛋白質研究所のRーAXIS装置で2.3Å分解能までの回折強度を測定した。これまでに得ているnative結晶とSm及びDy誘導体結晶の3.0Å分解能の回折強度デ-タと重原子位置からの位相情報を用いて,solvent flattening法による電子密度の改善を行った。このために,本研究費で購入したパソコン回折強度デ-タの前処理を行い。solvent flattening はパソコンで計算負荷が大きいためにEWSを使用して行った。得られた最善の位相により電子密度を計算した。この電子密度から溶媒領域と蛋白質は容易に区別でき、二次構造についてもある程度推定することができた。また,既に構造の明らかになっている亜鉛を活性部位に持つ蛋白質分解酵素サ-モリシンと茉膿菌からのエラスタ-ゼとの立体構造の比較より、セラチアプロテア-ゼの活性部位の構造はそれらの活性部位の構造に類似していることも推定できた。これらはアジア結晶学会(H4.11)で発表予定。

セラチア菌が生産する亜鉛を活性部位にもち,分子量51,000セラチアプロテア-ゼの分子構造と機能に関する研究の基礎として,以下の研究を行った。高分解能でのX線構造解析を行うために,結晶性が良く,0.5mm程度の大きな結晶がコンスタントに得られる条件の検討を行った。結晶化の直前にSephacryl Sー100を用いたカラムクロマトグラフィ-で精製した2%セラチアプロテア-ゼ,2% PEG6000,50mMりん酸緩衝液(pH6.0)を含む容液50μlを50mmりん酸緩衝液を含む25%硫酸アンモニウム容液(pH6.0)で1週間透析した後,硫酸アンモニウムの濃度を28%に上げることにより,約3週間で得られる結晶は実験室レベルX線回折装置でも2.0Å分解能の回折強度が得られることを確認し,大阪大学蛋白質研究所のRーAXIS装置で2.3Å分解能までの回折強度を測定した。これまでに得ているnative結晶とSm及びDy誘導体結晶の3.0Å分解能の回折強度デ-タと重原子位置からの位相情報を用いて,solvent flattening法による電子密度の改善を行った。このために,本研究費で購入したパソコン回折強度デ-タの前処理を行い。solvent flattening はパソコンで計算負荷が大きいためにEWSを使用して行った。得られた最善の位相により電子密度を計算した。この電子密度から溶媒領域と蛋白質は容易に区別でき、二次構造についてもある程度推定することができた。また,既に構造の明らかになっている亜鉛を活性部位に持つ蛋白質分解酵素サ-モリシンと茉膿菌からのエラスタ-ゼとの立体構造の比較より、セラチアプロテア-ゼの活性部位の構造はそれらの活性部位の構造に類似していることも推定できた。これらはアジア結晶学会(H4.11)で発表予定。