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金属酵素の反応機構解析の簡易化

金属酶反应机理分析的简化

基本信息

批准号：
06235213
负责人：
濱田賢作
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Shimane University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

セラチア菌からの分泌されるセラチアプロテアーゼは,抗炎症性などの薬理作用を持つ亜鉛金属蛋白質分解酵素である。触媒活性部位の亜鉛からの異常分散効果を利用するX線構造解析により,申請者らは立体構造を明らかにしていたが,さらに2.0Å分解能で構造の精密化を行った。その結果,亜鉛イオンはC末端ドメインの大きく,深い溝の底の位置しており,His176,HiS180,HiS186,Tyr216それに水分子が歪んだ三方両錐型で結合していた。その水分子はGlu177と水素結合していた。X線結晶構造解析に利用する波長領域では,CaのX線異常分散効果は非常に小さいために利用されていなかったが,高エネルギー物理学研究所放射光施設にて,波長1.283Åで測定した回折強度データのバイフット差フリエ-合成を行うことで容易にできるようにし,セラチアプロテアーゼには少なくとも4つのCa^<2+>が結合していることを明らかにした。これにより,セラチアプロテ-ゼで初めて見いだされβ-シートコイルと名付けられたまったく新規なモチーフ構造の形成にCa^<2+>イオンが不可欠であることを明らかにした。また,Caからの異常分散効果が大きな波長1.500Åでも,既に回折強度を測定を行い,解析は現在進行中である。セラチアプロテアーゼ結晶から亜鉛金属を除いたアポ酵素結晶は10mM_EDTAを含む35%飽和硫酸アンモニウム溶液(pH5.2)に4℃,6日間侵漬することで調製でき,これを2mM_MnCl_2を含む35%飽和硫酸アンモニウム溶液に2日間侵漬することでハロ酵素に変換できた。しかし,この調製では,大量の結晶がいること,長時間の保存に適さないことが判明した。そこで,溶液状態でハロ酵素に変換する方法を確立し,現在結晶化を試みている。なお,結晶化は本研究費で購入した恒温装置の使用で,安定して作成,保存ができるようになった。

Anti-inflammatory, anti-inflammatory, anti-inflammatory, anti- X-ray structural analysis of anomalous dispersion of catalyst active sites is used to clarify the three-dimensional structure of the applicant and to refine the structure of the 2.0-degree decomposition energy. As a result, the position of the bottom of the deep groove is located at the end of the C terminal,His176,HiS180,HiS 186,Tyr216, and the water molecules are combined in a triangular cone shape. The water molecule Glu177 binds to the water element. X-ray crystal structure analysis using wavelength domain,Ca X-ray anomalous dispersion effect is very small, using wavelength 1.283 nm, measuring intensity of reflection, difference in X-ray synthesis, easy to carry out, high temperature radiation, Institute of Physics radiation The number of entries in the list is less than 4 and the number of entries in the list is less than 4. This is the first time that we've seen the formation of a new structure, Ca^<2+>. The anomalous dispersion of Ca ~(2 +) was observed at wavelength 1.500 nm, and the intensity of reflection was measured. The analysis is in progress. The enzyme crystals were prepared from 10mM_EDTA solution containing 35% saturated sulfuric acid (pH 5.2) at 4℃ for 6 days and from 2mM_MnCl_2 solution containing 35% saturated sulfuric acid for 2 days. A large number of crystals are stored in the medium, and it is suitable for long-term preservation. The method of changing the state of the enzyme in solution was established, and the crystallization process was tried. However, the crystallization process is stable and stable due to the use of the thermostatic device purchased with this research fee, and can be preserved.