アスパラギン特異的エンドペプチダ-ゼの構造と生理的役割に関する研究

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本年度実施計画1、2はほぼ達成でき、研究の第一目的である本酵素のプロテア-ゼとしての位置付けを推定することができた。1.完熟タチナタマメ粉末の粗抽出液より、疎水性クロマト、チオ-ルアフィニテ-クロマト、疎水性クロマト、陽イオン交換クロマト、さらにHPLC用カラム単体使用での疎水性クロマト、高速ゲルろ過、再高速ゲルろ過の以上7段の精製操作を行いSDSーPAGE及び逆相HPLCクロマトでほぼ単一のバンド及びピ-クを与える精製酵素画分を5%の活性(DNPーPEAN・NH_2基質使用)収率で得た。尚、都合3回の疎水性クロマトは濃縮、脱塩をも兼ねており次の精製ステップを迅速に行なう為に有効であった。また精製溶媒に0.01%Brij35を含有させることで酵素の安定化も図ることができた。多段精製のため最終収率は低いが再現的に精製のできる事も確認した。2.至適pH(6付近)、環元Sー3ートリメチルアミノプロピルリゾチ-ムの消化ペプチド解析による切断特異性(Asnのみに特異的),各種プロテア-ゼ阻害剤の感受性(SH酵素様である)等の諸性質解析は部分精製酵素や未熟種子からの部分精製酵素と同等の結果が得られた。本酵素のアミノ酸配列分析ではアミノ末端より25残基(EVGTRXAVLAGSNGYGNYRHQADV)の配列を決定する事ができた。アミノ酸配列デ-タベ-ス(PRF)のホモロジ-検索をこの部分配列で行なうと既存のSH酵素(パパイン等)との相同性は認められなかったが、Schistosoma mansoniのSHプロテア-ゼで抗原蛋白質ともなっているSm32の配列と高い相同性(18/19)が観察された。このプロテア-ゼの一次配列も典型的なSHプロテア-ゼとは類似性が乏しく、この酵素とと同様に本酵素は新たなタイプのSHプロテア-ゼに分類されるベきものと推定された。蛋白質が必要なことからペプチドマップ等でのより一層の配列分析は今後に残された。