アスパラギン特異的エンドペプチダ-ゼの構造と生理的役割に関する研究

天冬酰胺特异性内肽酶的结构及生理作用研究

• 批准号: 03680133
• 负责人: 阿部 勇吉
• 金额: --
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03680133/
• 关键词: アスパラギン特異的エンドペプチダ-ゼ; システインプロテア-ゼ; 種子プロテア-ゼ; 貯蔵蛋白プロセシング酵素; マンソン吸虫ヘモグロビナ-ゼ; ASNAIN

本年度実施計画1、2はほぼ達成でき、研究の第一目的である本酵素のプロテア-ゼとしての位置付けを推定することができた。1.完熟タチナタマメ粉末の粗抽出液より、疎水性クロマト、チオ-ルアフィニテ-クロマト、疎水性クロマト、陽イオン交換クロマト、さらにHPLC用カラム単体使用での疎水性クロマト、高速ゲルろ過、再高速ゲルろ過の以上7段の精製操作を行いSDSーPAGE及び逆相HPLCクロマトでほぼ単一のバンド及びピ-クを与える精製酵素画分を5%の活性(DNPーPEAN・NH_2基質使用)収率で得た。尚、都合3回の疎水性クロマトは濃縮、脱塩をも兼ねており次の精製ステップを迅速に行なう為に有効であった。また精製溶媒に0.01%Brij35を含有させることで酵素の安定化も図ることができた。多段精製のため最終収率は低いが再現的に精製のできる事も確認した。2.至適pH(6付近)、環元Sー3ートリメチルアミノプロピルリゾチ-ムの消化ペプチド解析による切断特異性(Asnのみに特異的),各種プロテア-ゼ阻害剤の感受性(SH酵素様である)等の諸性質解析は部分精製酵素や未熟種子からの部分精製酵素と同等の結果が得られた。本酵素のアミノ酸配列分析ではアミノ末端より25残基(EVGTRXAVLAGSNGYGNYRHQADV)の配列を決定する事ができた。アミノ酸配列デ-タベ-ス(PRF)のホモロジ-検索をこの部分配列で行なうと既存のSH酵素(パパイン等)との相同性は認められなかったが、Schistosoma mansoniのSHプロテア-ゼで抗原蛋白質ともなっているSm32の配列と高い相同性(18/19)が観察された。このプロテア-ゼの一次配列も典型的なSHプロテア-ゼとは類似性が乏しく、この酵素とと同様に本酵素は新たなタイプのSHプロテア-ゼに分類されるベきものと推定された。蛋白質が必要なことからペプチドマップ等でのより一層の配列分析は今後に残された。

This year's implementation plan 1 and 2 achieved the first goal of the study. 1. The crude extract of the powder is completely prepared, and the aqueous phase is completely prepared. The aqueous phase is completely prepared, and the cationic phase is completely prepared. The aqueous phase is completely prepared, and the high-speed phase is completely prepared. The activity of the purified enzyme was 5%(DNP-PEAN·NH_2 substrate) when SDS PAGE and reverse phase HPLC were used. The water quality of the three parts of the city is concentrated, removed and refined quickly. Purified solvent 0.01% Brij35 contains the enzyme stabilizer. Multi-stage refining and final production rate is low and reproduction is refined and confirmed. 2. The analysis of properties such as appropriate pH(near 6), cleavage specificity (Asn specific) of digestion and selection of ring S-3, susceptibility to various kinds of inhibitors (SH enzyme), partial purification enzyme and immature seed, partial purification enzyme and equivalent results were obtained. The sequence of the 25-residue (EVGTRXAVLAGSNGYGNYRHQADV) in the enzyme was determined by acid sequence analysis. The identity of the existing SH enzyme (PRF) and the high identity (18/19) of the Schistosoma mansoni SH antigen protein were observed. The first sequence of these enzymes is typically similar to the first sequence of these enzymes. Protein is necessary for the analysis of protein sequence.