色素体DNA結合蛋白質に着目した色素体の新しい分類法

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本研究の目的は、色素体DNA結合蛋白質の分子種に基づいて、色素体の新しい分類法の可能性を探ることにある。そのためには、植物の種々の組織に含まれる色素体のDNA結合蛋白質を同定する方法を開発しなければならない。この目的にもっとも適した方法は、植物の組織切片を作成して、その切片上で免疫組織化学的にこの蛋白質を検出することである。本研究では、テクノビット樹脂を使用した間接蛍光抗体法を行うことにした。昨年度の結果より、超薄切片上で色素体DNA結合蛋白質を間接蛍光抗体法により同定するためには、試料を固定後、脱水剤としてアセトンを用い、また脱水およびテクノビット樹脂置換の各過程で、常にノニデットP-40を小量加えておくことが重要であることが解った。それ以外の方法では、抗原蛋白質を検出することができなかった。そこで、今年度、実際にタバコ培養細胞BY-2をテクノビット樹脂に包埋して、切片を作成し、原色素体DNAと結合している原色素体DNA結合蛋白質を同定することを行った。その結果、切片上で通常の蛍光抗体法を行なっても、抗原である原色素体DNA結合蛋白質を検出することはできなかったが、抗体処理の前に切片を過ヨウ素酸ナトリウムで処理することによりエッチングしておくと、極めて弱いものであるが、抗原に特異的にFITCの蛍光を観察することができ、その部位は、DAPI蛍光により観察される原色素体の内部のDNA領域と一致した。この結果から、細胞分画法によりタバコ培養細胞から単離した原色素体核様体に、もっとも大量に含まれるDNA結合蛋白質として生化学的に同定した69kD原色素体DNA結合蛋白質は、確かにこの培養細胞において原色素体DNAと結合していることが示された。現在、エッチングの方法をさらに最適化し、蛍光シグナルの強度を高めることを行なっており、改善されれば、植物の各組織の切片に適用して、この原色素体DNA結合蛋白質の存在部位を決定する予定である。