原色素体および葉緑体のDNA結合蛋白質の遺伝子の解析

原生质体和叶绿体中 DNA 结合蛋白基因的分析

• 批准号: 04257205
• 负责人: 根本 泰行
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04257205/
• 关键词: DNA結合蛋白質; 原色素体; 色素体; 葉緑体

原色素体には大量に含まれているが、葉緑体には検出されない分子量69kDの色素体DNA結合蛋白質の遺伝子をクローニングし、その構造を明らかにすることが本研究の目的である。そのために、今年度はこの蛋白質の部分アミノ酸配列の決定を行った。まず、タバコ培養細胞から原色素体核様体を大量に単離した後、低濃度の塩で洗いさらに高濃度の塩で処理することにより、比較的強固にDNAと結合している目的蛋白質を濃縮した。SDS-PAGEを行った後、目的バンドを含むゲルを切り出し、さらに電気泳動により、蛋白質をゲルから溶出するとともに濃縮した。クリーブランド法によりV8で部分的に消化して再び電気泳動し、SDSを0.02%含む緩衝液により、グラシーボンド膜に対してウエスタン・ブロットを行った。各ペプチドのバンドを切り出し、ペプチド・シークエンサー(Applied Biosystems、477A)によりN末端のアミノ酸配列を調べた。その結果、V8プロテアーゼで処理すると、69kDの蛋白質がまず52kDと16kDに切断され、さらにこの52kDが14kDと38kDに切断されることが解った。69kDの蛋白質、および、52kD、38kD、16kDの各ペプチド断片について、N末端のアミノ酸配列を調べたところ、69kDのN末端は???-???-Thr-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Ala-Asn-Glu-Proであり、また52kDが同じ配列であったことから、この配列は間違いなく本蛋白質のN末端であると考えられる。38kDと16kDはそれぞれ独自の配列であった。今後、この配列の基にDNAプローブを作製し、また、未同定の部分に関してはさらに大量の蛋白質を試料に用いてアミノ酸配列の決定を繰り返す予定である。

Prochromatosome DNA binding protein with molecular weight of 69kD was detected in a large number of chromosomes and chloroplasts. This year, the protein and its partial amino acid sequence were determined. The protein of interest is concentrated in the culture of cells, protoplasts, and nuclei at low concentrations and high concentrations. After SDS-PAGE, the target protein was extracted and concentrated. For example, if you use a 0.02% SDS buffer solution, you will be able to digest the V8 part of the solution. Each of the selected sites is selected from the list of sites (Applied Biosystems, 477A), and the N-terminal site is selected from the list of sites. As a result, V8 protein was cut off from 52kD to 16kD, and 52 kD to 14kD to 38kD. 69kD protein,, 52kD, 38kD, 16kD protein fragments, N-terminal amino acid sequence, 69 kD N-terminal amino acid sequence, 69 kD protein fragments, 52 kD, 38 kD, 16 kD protein fragments, 69kD protein fragments Thr-Pro-Ala-Lys-Pro-Ala-Ala-Asn-Glu-Pro 38kD 16kD In the future, the DNA sequence of this sequence will be determined in the presence of a large number of protein samples.

项目成果

Toshiyuki NAGATA,Yasuyuki NEMOTO,Seiichiro HASEZAWA: "Tobacco BY-2 Cell Line as the ¨HeLa¨ Cell in the Cell Biology of Higher Plants." Int.Rev.Cytol.132. 1-30 (1992)

Toshiyuki NAGATA、Yasuyuki NEMOTO、Seiichiro HASEZAWA：“烟草 BY-2 细胞系作为高等植物细胞生物学中的“HeLa”细胞。”Int.Rev.Cytol.132。