新しい生理機能を持つNADHoxidase遺伝子のクロ-ニングと機能的発現

具有新生理功能的NADH氧化酶基因的克隆及功能表达

• 批准号: 03650794
• 负责人: 新村 洋一
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03650794/
• 关键词: NADHoxidase; Amphibacillus; Amphibacillus xylanus

NADHoxidaseはNADHを分子状酵素で酸化し、過酸化水素または水を生ずる酵素であるが、その機能及び微生物における生理的役割については不明な点が多い。我々はNmphibacillus xylanusのNADHoxidaseについて研究し、それが菌体内酸化還元バランスの維持、および酸素毒性防御へ直接関与することを明らかにしてきた。一方、本酵素が安定で強力なためバイオセンサ-、バイオリアクタ-への応用も期待され、本酵素反応機構解析と多量生産を図るため、当該酵素遺伝子のクロ-ニングと解析を試みた。今回はこれらについて得られた成果を報告する。1.NADHoxidase全構造遺伝子を含む9kbDNA断片を持つ、大腸菌のクロ-ンを得た。このクロ-ンの全菌体タンパクに対し抗NADHoxidase抗体を用いてMestern blottingを行ったところ、A.xylanusのNADHoxidaseと同じ分子量のバンドが確認された。またNADHoxidase活性の発現も観察された。2.9kb断片のうち、本酵素遺伝子が位置すると考えられる2kb断片の塩基配列を決定したところ、1527bpのOpen reading frameが確認され、A.xylanus NADHoxidaseと同じ分子量(55,000)のタンパクのコ-ドが推定された。3.親株のNADHoxidaseタンパクのN末端アミノ酸配列を16残基決定し、DNA配列より推定されるアミノ酸一次配列と比較した。両者は完全に一致し、全アミノ酸組成も一致した。4.推定された本酵素のアミノ酸一次配列は、BacillusのNADHehydrogenaseの配列と73%の相同性を示し、本NADHoxidaseがNADHdehydrogenase活性を推定されるシステイン残基も複数観察された。本酵素はNADHoxidase活性の他、peroxidase,dehydrogenase活性をも有することが明らかになっている。本酵素の多機能性と今回明らかになった複数の触媒部位について、今後さらに検討してゆきたい。

NADHoxidase is a molecular enzyme that acidifies and peracidifies water and produces water. It has many functions and physiological functions. We are interested in the study of NADH oxidase in Bacillus xylanus and its maintenance and protection against acid toxicity. On the one hand, the enzyme is stable and powerful, and the enzyme is expected to be used in the analysis of the enzyme reaction mechanism and the production of large quantities. When the enzyme reaction mechanism is analyzed, it is tested. This is the first time I've ever seen one. 1. The complete sequence of NADH oxidase contains 9 kb DNA fragments and E. coli DNA fragments. A.xylanus NADHoxidase and A.xylanus NADHoxidase were identified by using Western blotting to detect the presence of anti-NADHoxidase antibodies. The expression of NADHoxidase activity was observed. 2. The nucleotide sequence of the 9kb fragment was determined by the sequence analysis of the 2kb fragment, the Open reading frame of 1527bp was confirmed, and the molecular weight of A.xylanus NADH oxidase was estimated to be 55,000. 3. N-terminal nucleotide alignment of the parent NADH oxidase sequence was determined by 16 residues, DNA alignment was estimated by 16 residues, and nucleotide alignment was compared. The composition of the acid is completely consistent. 4. The putative sequence of NADH dehydrogenase residues in Bacillus showed 73% identity. The putative sequence of NADH dehydrogenase residues in Bacillus showed 73% identity. The enzyme has NADH oxidase activity, peroxidase activity,dehydrogenase activity, and so on. The versatility of this enzyme is not only in the present but also in the future.

项目成果

Youichi Niimura,Hideo Suzuki et al: "Purification,Cloning and Nucleotide Sequence of NADHoxidase from Amphibacillus xylanus" The Journal of Biological Chemistry. (1992)

Youichi Niimura、Hideo Suzuki 等人：“来自 Amphibacillus xylanus 的 NADH 氧化酶的纯化、克隆和核苷酸序列”生物化学杂志。