酸素反応の限界に近い高速で過酸化物を分解する酸素遺伝子のクローニングと機能的発現

以接近氧反应极限的高速率分解过氧化物的氧基因的克隆和功能表达

• 批准号: 08650952
• 负责人: 新村 洋一
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Tokyo University of Agriculture
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08650952/
• 关键词: NADH oxidase; Amphibacillus; alkyl hydroperoxide reductase; Amphibacillus xylanus; AhpC

高活性で、安定な過酸化物分解酵素の開発は、医学分野のみならずバイオリアクター等生産分野で重要な課題である。Amphibacillus xylamusで発見された過酸化物分解酵素系は、既知の分解酵素よりも反応速度と基質親和力がずばぬけて高く、無機、有機の過酸化物に対する幅広い基質特異性を有しており、応用面で極めて有用な酵素と期待される。しかしながら、A.xylamusは菌体収量が低く、プロテアーゼ活性が高いなど酵素生産上の欠点が多い。そこで本研究は、過酸化物分解酵素系を構成するC_<【similar or equal】>タンパク(AhpC)の全構造遺伝子をクローニングし、NADH oxidase遺伝子とともに、適切な宿主・ベクター系を用いてこれら両遺伝子大量発現を目的とす1.過酸化物分解酵素系を構成するAhpC全遺伝子のクローニングと全塩基配列の決定。すでに得られているAhpC部分遺伝子をプローブとしてAmphibacillus xylanusのDNAライブラリーにより全構造遺伝子を取得し、全塩基配列を決定した。AhpC遺伝子はNADH oxidase遺伝子の15bp〜580bp上流に存在した。2.過酸化物分解酵素系を構成するAhpCとNADH oxidaseの機能的発現。Ptacプロモーター下流にAhpCとNADH oxidaseを連結し、大腸菌を宿主として両タンパクを発現させた。大腸菌で発現したAhpCとNADH oxidaseそれぞれ精製し、再構成したところ、親株(A.xylanus)と同様な過酸化物分解活性が確認された。AhpCとNADH oxidaseの関与する過酸化物分解酵素系の機能的大量発現に成功した。この酵素系の反応速度は、酵素反応の限界に近い高速である。今回得られた大量発現系を用いて高速活性反応の解析を行ってゆきたい。

The development of high activity, stable and peracidifying enzymes is an important topic in the production field of medicine. Amphibacillus xylamus has been identified as a family of enzymes for the decomposition of peracidifiers. The enzyme system is known to be a catabolic enzyme, and its reaction rate and substrate affinity are high. Inorganic and organic peracidifiers have a broad range of substrate specificity, and the enzyme system is expected to be useful. A.xylamus has low cell count, high enzyme activity, and many deficiencies in enzyme production The purpose of this study is to determine the composition of peracid-decomposing enzyme system and the sequence of NADH oxidase gene in AhpC. The AhpC partial gene was obtained from Amphibacillus xylanus DNA and the complete gene sequence was determined. AhpC gene contains NADH oxidase gene from 15bp to 580bp upstream. 2. Peracidifying enzymes constitute the functional development of AhpC and NADH oxidase. Ptac is a downstream enzyme linked to NADH and E. coli. Escherichia coli was found to have NADH oxidase, which was purified, reconstituted, and its parent strain (A.xylanus) was found to have acid decomposing activity. A large number of functions of the peracid-decomposing enzyme system related to AhpC and NADH oxidase have been successfully discovered. The enzyme system's reaction speed is low, the enzyme reaction speed is low, and the enzyme reaction speed is high. A large number of discovery systems have been developed for high-speed reactive analysis.

项目成果

Youich Niimura and Vincent Massey: "Reaction Mechanism of Amphibacillus xylanus NADH oxidase/Alkyl Hydroperoxide Reductase Flavoprotein" THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. 271巻485号. 30459-30464 (1996)

Youich Niimura 和 Vincent Massey：“木双杆菌 NADH 氧化酶/烷基氢过氧化物还原酶黄蛋白的反应机制”生物化学杂志，第 271 卷，第 485 期。30459-30464 (1996)

Youichi Niimura: "Amphibacillus xylanus NADH oxidase/alkyl hydroperoxide reductase flavoprotein" Flavins and Flavoproteins. (印刷中). (1997)

Youichi Niimura：“木双杆菌 NADH 氧化酶/烷基氢过氧化物还原酶黄素蛋白”黄素和黄素蛋白（1997 年出版）。