遺伝子光学的に改質した大豆グリシニンの迅速評価システムの構築

转基因光学大豆甘氨酸快速评价体系的构建

• 批准号: 05760018
• 负责人: 勝部 朋之
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Shimane Prefectual Shimane Women's College
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05760018/
• 关键词: 大豆グリシニン; 遺伝子光学的改質; 一過性発現; エレクトロポレーション

大豆グリシニン遺伝子の遺伝子工学的改質の成否を迅速に評価するために、エレクトロポレーション法による未熟子葉細胞での一過性発現系の確立を試みた。大豆品種ワセスズナリ(wild)およびそのグリシニングループI欠失変異体(mutant)を慣行法により栽培し、播種後日数(DAS)の異なる各未熟子葉よりプロトプラストを調製した。プロトプラストの単離効率はDASの増加とともに低下した。プロトプラストにCaMV35Sプロモータ支配下のbeta-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子を導入し、外来遺伝子導入・発現効率の指標としてその酵素活性を調べた。GUS活性値はプロトプラストの状態に大きく依存し、DASの増加とともに低い値を示す傾向にあった。品種(wild,mutant)による差は認められなかった。電場強度(EFS)が400-1000V/cmの間では、EFSの増加とともにGUS活性値は高くなった。1000V/cm以上においてはGUS活性値は頭打ちとなった。パルス長(gamma)が5-40msの間ではgammaが増加するにつれてGUS活性値も高くなった。ただしgammaが高いほど、低いEFSにおいてEFSに対するGUS活性値の変化が急激になり、高いEFSでの変化は緩慢となった。ポレーション緩衝液にポリエチレングリコール(PEG)を加えたところ、GUS活性値は大きく増加した。ただし、プロトプラストにDNAを添加する前にPEGを加えると、逆にほとんどGUS活性を示さなかった。ポレーション後の培養条件(培地組成、細胞密度)を変えてGUS活性に及ぼす影響を調べたが差は認められず、GUS活性値は培養開始後48時間目まではほぼ直線的に増加し、以後速やかに減少した。得られた最適条件において、抗GUS抗体によるGUSタンパク質の検出を試みたが検出できなかった。また同様に、グリシニン遺伝子をCaMV35Sプロモータ、グリシニンプロモータ、beta-コングリシニンプロモータに各々連結したプラスミドをmutantに導入し、抗グリシニン抗体を用いてグリシニンの検出を試みたが検出できず、引き続き調査している。

Rapid evaluation of the success or failure of genetic engineering of soybean cotyledons and establishment of transient development systems in immature cotyledons Soybean varieties are cultivated in different ways, days after sowing (DAS), and immature cotyledons are cultivated in different ways. The rate of separation of the two groups increased significantly. The enzyme activity of CaMV 35S was modulated as an indicator of the efficiency of gene introduction and gene expression under the control of CaMV 35S. GUS activity is highly dependent on DAS activity. Variety (wild,mutant) The electric field intensity (EFS) varied from 400 V/cm to 1000V/cm, and the EFS increased. Above 1000V/cm, the GUS activity is higher. GUS activity is high when gamma increases between 5 and 40 ms. GUS activity changes rapidly from high to low EFS and slowly from high to low EFS. The activity of GUS increased greatly when PEG was added to the buffer. PEGs were added to the DNA and the GUS activity was demonstrated. The culture conditions (culture composition, cell density) after culture were changed to adjust the GUS activity. The GUS activity increased linearly after 48 hours of culture, and then decreased. The optimal conditions for GUS antibody detection were obtained. In addition to the above, the study of CaMV 35S, CaMV 35S, Ca