バチルス属の生産するサイクロデキストリン生成酵素に関する蛋白質工学的研究

芽孢杆菌产环糊精酶的蛋白质工程研究

• 批准号: 05760062
• 负责人: 中村 顕
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05760062/
• 关键词: Bacillus ohbensis; cyclodextrin glucanotrasferase; starch-degrading activity; CD synthesis activity; site-directed mutagenesis; gamma-CGTase

Bacillus ohbensisのサイクロデキストリン生成酵素(CGTase)遺伝子に対して部位特異的変異を行い、188位のアミノ酸を野生型のTyrから、既に作製したものも含めて、残りの19種類のアミノ酸に置換した変異遺伝子を構築した。変異遺伝子を枯草菌に導入し、各種変異酵素を枯草菌の培養上清より生澱粉吸着法を用いて精製した。変異酵素はいずれも程度の差はあるものの、澱粉分解活性とサイクロデキストリン(CD)合成能を有していた。また生成するCDはいずれの酵素の場合も野生型と同様のbeta-及びgamma-CDであり、alpha-CDの生成は認められなかった。野生型酵素、野生型と同様の性質を示したPhe188変異酵素、及びgamma-CD生産性の向上したTrp188変異酵素について、各CDを分解する反応におけるkinetic parameterを測定したところ、Phe188変異酵素では野生型と比較して大きな差は認められなかったものの、Trp188変異酵素ではgamma-CDに対するKm値が約8倍に上昇している事が観察され、その結果、gamma-CDに対するkcat/Km値が野生型の約1/4に減少していた。Trp188変異酵素は一度生成したgamma-CDを分解する活性が弱くなっており、その結果gamma-CDを蓄積するようになったものと考えられる。176位と252位に位置するPhe残基をTrpあるいはTyrに置換した変異酵素を上記と同様の方法で作製したが、その酵素活性に特に大きな変化は認められなかった。将来は野生型、及びTrp188変異酵素について、その結晶化とX線構造解析を行ない、188位のアミノ酸のCD生成に果たす役割について立体構造の面から解析する事が考えられる。

Bacillus ohbensis is sensitive to the production of enzymes (CGTase), which is specific to the location of the enzyme, the wild type of CGTase, the wild type of enzyme, the wild type of enzyme, the enzyme that contains the enzyme, and the residue of the enzyme, which is similar to the one in which the enzyme is detected. All kinds of enzymes were introduced into the culture of B. subtilis, the supernatant was cultured, and the raw powder was absorbed by the method of absorption of raw powder. The synthesis energy of CD is different from that of enzyme and powder decomposition activity. CD production, enzyme synthesis, wild type production, beta- and gamma-CD production, alpha-CD production. Wild-type enzyme, wild-type enzyme homozygous show that Phe188 enzyme, and gamma-CD enzyme up-step Trp188 enzyme assay, CD enzyme decomposition reverse enzyme kinetic parameter assay, Phe188 enzyme assay, Phe188 enzyme assay, wild-type enzyme assay, differential enzyme assay, enzyme analysis, enzyme analysis, enzyme The Trp188 enzyme enzyme, the gamma-CD enzyme, the Km enzyme, the gamma-CD enzyme, the kcat/Km enzyme, the wild type, the wild type and the wild type. For a time, Trp188 enzyme produced gamma-CD decomposition activity. The activity was weak. The results showed that the gamma-CD was stored and tested. Phe residues at position 252, Trp, Tyr, enzyme, enzyme, enzyme activity, enzyme activity, enzyme activity. In the future, the wild type and Trp188 enzyme will be used to analyze the X-ray analysis, and the 188-bit acid CD will be used to cut the solid surface.

项目成果

Kyeong-A Sin et al.: "Replacement of an amino acid residue of cyclodextrin glucanotransferase of Bacillus ohbensis doubles the production of gamma-cyclodextrin" J.Biotechnol.(in press). (1994)

Kyeong-A Sin 等人：“替代芽孢杆菌环糊精葡聚糖转移酶的氨基酸残基使 γ-环糊精的产量翻倍”J.Biotechnol.（出版中）。