エビタケ由来ビリルビンオキシダーゼの反応機構と構造

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本研究では、エビタケ由来のビリルビンオキシダーゼについて、反応速度論的および構造論的研究を行った。1.反応速度論的研究:本酵素はビリルビンの他にアスコルビン酸やフェノールなどを基質とするので、これらに対する速度パラメータを測定した。ジタウロビリルビン、アスコルビン酸に対するKm、K_<cat>はそれぞれ8.4±0.6muM、1.7±0.2mM、490±20s^<-1>、75±3s^<-1>と求められた。また本酵素の酸素に対するKm、K_<cat>はそれぞれ110±10muM、160±10s^<-1>となった。次に本酵素は、各種陰イオンによって活性が阻害されるが、その中で最も阻害の強いN_3^-の阻害について、その阻害形式と阻害物質定数を調べた。その結果、N_3^-はアスコルビン酸に対しては非拮抗的に阻害し、その阻害物質定数(Ki)は0.36±0.05muMであった。これに対して、もう一つの基質である酸素に対しては、Ki値が0.36±0.06muMとほぼ等しいものの、阻害形式は不拮抗型であった。またN_3^-、はアスコルビン酸によるタイプ1銅の還元速度にほとんど影響を与えなかった。以上の結果より、N_3^-はアスコルビン酸や酸素とは異なる部位に結合して酵素活性を阻害すると推定された。2.構造論的研究:遺伝子のクローニングを行うために、酵素の部分アミノ酸配列を決定した。まず本酵素を臭化シアン分解およびリシルエンドペプチダーゼ消化を行い、分離したペプチドをプロテインシーケンサーにかけることにより、約580残基中200残基以上のアミノ酸配列を決定することが出来た。この結果を用いてPCR法でクローニングを行い、ほぼ全長を含む2つのポジティブクローンが得られ、現在ケ-ケンシング中である。一方、X線結晶構造解析を行うための単結晶の調製を種々の条件で試みた所、(NH_4)_2SO_4より一辺が約0.1〜0.2mmのサイコロ状の結晶が得られた。現在、得られた結晶の結晶学的性質について検討中である。