マルチ銅酵素の構造と反応機構に関する研究

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平成6年度研究代表者は、交付申請書に記載した様にマルチ銅酸化酵素であるエビタケ(Trachyderma tsunodae K-2593)由来ビリルビン酸化酵素と、糸状菌Acremonium sp.HI-25由来のアスコルビン酸酸化酵素の構造と機能に関する研究を行った。まず前者の酵素に関しては、部分アミノ酸配列をもとにオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、PCR法でcDNAライブラリーから酵素遺伝子をクローン化した。その結果、開始コドンからポリA配列までの全長を含むクローンが得られ、その塩基配列及び推定アミノ酸配列を明らかにした。また、その配列をプロテインデータベースに対して検索したところ、相同性の高い蛋白質が見いだされた。現在本遺伝子の酵母内での発現を試みている。一方これまで研究代表者は、X線結晶解析を行うために本酵素の単結晶の調製を試みてきた。しかしながら昨年度までに得られた結晶はX線回析像を示さず、結晶解析には適さない事が判明した。そこで本年度は多様な結晶化条件を試みたところ、これまでに得られたものとは結晶形が異なり、しかも明瞭な偏光を示す結晶が得られた。そこで、今後はこの結晶がX線解析に適するかどうかを確かめ、酵素の立体構造の解析を行う予定である。次に後者のAcremonium由来のアスコルビン酸酸化酵素については、これまで研究代表者らは本酵素が高等植物由来のアスコルビン酸酸化酵素の単量体とよく似た反応速度論的及び分光学的性質を持つことを明らかにしてきた。そこで本年度は、本酵素および上記のビリルビン酸化酵素のタイプ1銅の酸化還元電位を測定したところ、Acremonium由来のアスコルビン酸酸化酵素の酸化還元電位は、ラッカーゼやビリルビン酸化酵素に比べて低く、高等植物由来のアスコルビン酸酸化酵素に近いことが判明した。