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高等植物における薬物代謝機構の遺伝子工学による解析

基因工程分析高等植物药物代谢机制

基本信息

批准号：
05760259
负责人：
今石浩正
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05760259/
关键词：
NADPH-P450還元酵素 P450 BY2 薬物代謝

项目摘要

1.タバコ懸濁培養細胞株BY2に対する各種薬剤によるP450の誘導効果を検討した。BY2に、2,4-Dおよびクロロトルロンを添加した結果、P450含量は約1.5倍に誘導されることが明らかとなった。-方、酵素活性は、トランス珪皮酸水酸化活性と、7エトキシクマリン脱エチル化活性が約2倍に誘導された。2.BY2からP450の精製を行った。BY2から超遠心法を用いて調整したミクロソーム画分を、エマルゲン911を用いて可溶化した後、DEAEイオン交換、ヒドロキシアパタイト、CMイオン交換クロマトグラフィーを用いてP450を精製した。SDSゲル電気泳動で解析した結果、精製酵素標品は、約55000の分子量を持つことが判明した。また、この精製酵素標品にラットのP450還元酵素を添加し、再構成系の実験を行った結果、この精製P450はトランス珪皮酸水酸化反応を触媒することが判った。3.BY2からNADPH-P450還元酵素の精製を行った。BY2から超遠心法を用いて調整したミクロソーム画分を、エマルゲン911を用いて可溶化した後、Qセファーロス陰イオン交換、ADPセファロースアフィニティー、DEAE陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてP450還元酵素を均一精製した。SDSゲル電気泳動で解析した結果、精製酵素標品は、約79000の分子量を持つことが判明した。さらに、この精製酵素標品に対する抗体を作成し、親植物のタバコの各組織中での発現量をウエスタンブロット法を用いて解析した結果、本精製構想標品は根、芽、葉のミクロソーム画分に発現していることが判明した。4.P450還元酵素の部分アミノ酸配列を決定し、それをもとにDNAプローブを合成した。市販のcDNAライブラリーを用いてスクリーニングを検討した結果、6個の陽性のクローンを得た。現在、このクローンに対して検討を加えている。

1. The induction effect of P450 in suspension culture cell line BY2 was discussed. BY2, 2,4-D and P450 were added. The content of P450 was about 1.5 times that of BY2, 2,4-D. Recipe, enzyme activity, enzyme 2. BY2 P450 BY2: The remote control method is used to adjust the number of components, and the number of components. SDS electrophoresis analysis results, refined enzyme standard, molecular weight of about 55000 The purified enzyme standard P450 reducing enzyme was added to the reaction system and the purified P450 reducing enzyme was used as a catalyst for acid hydrolysis. 3.BY2 NADPH-P450 Reductant enzyme purification. BY2 is a new method for the purification of P450 reducing enzyme. It is used to adjust the concentration of P450 reducing enzyme. SDS electrophoresis analysis results, refined enzyme standard, molecular weight of about 79000 In addition, the purified enzyme standard was prepared, and the amount of protein in each tissue of the plant was determined by the method of enzyme analysis. The purified enzyme standard was identified by the method of enzyme analysis. 4. P450 is the enzyme that determines the sequence of DNA. The results of the search were obtained by using the cDNA search engine. Six positive search engines were obtained. Now, this is the first time I've seen you.