トリパノソーマ原虫で見出されたras関連遺伝子のクローニング

锥虫原生动物中发现的 ras 相关基因的克隆

• 批准号: 05770176
• 负责人: 松田 信治
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Kyoto Prefectural University of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05770176/
• 关键词: Trypanosoma brucei gambiense; c-H-ras; ノーザンブロッテイング; サザンブロッテイング

感染マウス流血中からDEAE-セルロースカラムにより99%以上の純度で分離できたTrypanosoma brucei gambiense(Tbg)を材料に、既に抽出してあったgenomic DNAおよびとtotal RNAを使用した。まず、total RNAに対してノーザンブロッティングを行い、転写産物のレベルでc-H-ras類似関連遺伝子が存在するかどうかを確認した。当初の、c-H-ras cDNAをインサートに持つプラスミドから作製したプローブを用いた実験では、陽性対照のヒト株化腫瘍細胞Ej中に発現しているc-H-ras mRNAと同じ長さのあたりに、弱いシグナルが得られた。更にTbgのmRNAを分離精製して解析を進めるために、spliced leader配列の39塩基中、5'末端側の25塩基配列に対して相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドをビオチン-ラベルで合成し、これと水素結合したmRNAをストレプトアビジン結合磁気ビーズにより回収する方法を採用した。結果は、同時に比較として行なった従来のoligo-dTリガンド結合磁気ビーズを用いたものより回収率は良好であった。これにより集めたTbgのmRNAを対象にノーザンブロット解析を行った。当初のものより厳密にc-H-rasのcDNA領域に限定したプローブを作製して、このmRNAポピュレーションを調べると、比較的強いシグナルを与えるバンドが、Ej細胞中のc-H-ras mRNAの半分ほどの長さのあたりに認められた。次いでハイブイダイゼーションによるクローニングを行なうため、サザンブロット解析による条件設定を行なった。先述のgenomicDNAをDralによって消化し、電気泳動後ナイロンメンブレインに転写た後、先述の新たに作製し直したプローブを用いて、複数のシグナルを得た。最後に、さきに分離精製したTog mRNAから、通常の方法でcDNA二重鎖を合成し、lambdaMOSSloxファジ-ベクター及び、現報告者らが開発したpKE1プラスミドベクターにつないで、各々ハイブリダイゼーションにより陽性ベクターを釣り上げ、第2、第3次スクリーニングを行い、ベクターの標的を絞りこんだ。この後、pBluescript系ファージミッドベクターへサブクローニングを行い、ジデオキシ法にて塩基配列を解析中である。

The purity of the isolated Trypanosoma brucei gambiense(Tbg) is more than 99%. The total RNA sequence was determined by the presence of c-H-ras-like genes in the sequence. c-H-ras mRNA was found in Ej cells of positive control plants, and c-H-ras mRNA was found in Ej cells of positive control plants. In addition, Tbg mRNA was isolated and purified, and the analysis was further carried out. The spliced leader was arranged in the 39-base and 25-base at the 5'end of the Tbg mRNA. The complementary leader was arranged in the 39-base and 25-base at the 5' end of the Tbg mRNA. The results showed that the recovery rate of the two groups was good. The expression of Tbg mRNA was detected by PCR. The cDNA domain of c-H-ras in Ej cells is restricted to the expression of c-H-ras mRNA, and the mRNA domain is regulated and compared with c-H-ras mRNA domain. In the middle of the game, the game is played, and the game is played. After the genomic DNA is digested and electrophored, the novel DNA is produced and used. Finally, the isolation and purification of Tog mRNA, the usual method of cDNA double-lock synthesis, lambda MOSSlox, and the present reporter have been reported. pKE1, pKE1, pKE1, After this, the pjescript system is in the middle of the analysis of the base configuration.