ガス壊疽菌コラゲナーゼの反応機構の解析

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1.性状の解析本酵素の性状をアゾコール分解活性を指標に解析した。活性はpH4.5〜9.0の広い範囲で認められ、至適pHはホウ酸バッファーで7.2、リン酸バッファーで7.0であった。至適温度は42°Cであった。10mM CaCl_2存在下で1mMのo-phenanthrolineの添加により完全に阻害された。これらの結果から、本酵素はNeutral metalloproteaseである事が示唆された。酵素標品中の2価金属イオンを、5mM過剰のEDTA添加とSephadex G-10カラムによって除去した後、種々の2価金属イオンを再添加して、金属イオン要求性を調べた。30muMnoZn^<2+>添加によって酵素活性が最も回復したのにたいし、Ca^<2+>では1mM以上の濃度が活性の回復(90%)に必要であった。また、Mg^<2+>では約30%の回復しか得られなかった。以上より、本酵素はZn-proteaseであると結論された。2.産生系の確立本酵素の金属結合部位を特定するためには、部位特異適突然変異導入による解析が有効である。その前段階として、本酵素の大腸菌中での発現系を得る事を試みた。本酵素構造遺伝子をプラスミド上でT3 promorterの下流に連結し、え.coli BL21(pTG119)にtransformした。本菌では、IPTG添加によりT3 RNA polymeraseの発現が誘導され、その結果collagenaseの大量生産が可能なはずである。ところが実際には、IPTGを添加すると菌の増殖が停止し、collagenase活性の誘導は僅かであった。ペリプラスム画分からImmunoblottingによりcollagenase関連抗原を検出を試みると、authentic proteinと同じ分子量の抗原は僅かであり、分子量の小さい抗原が多種多量に観察された。転写または翻訳レベルでの酵素産生の中絶が示唆された。以上の問題を解決するため、本来の宿主であるC.perfringensの持つcollagenase遺伝子(colA)をgene targettingにより除去し、colAを持つplasmidをC.perfringens colA変異株に形質転換する事により、本酵素の構造活性相関に関する詳細な解析を進める予定である。