ガス壊疽菌コラゲナーゼの反応機構の解析

坏疽坏疽胶原酶反应机制分析

• 批准号: 05770193
• 负责人: 松下 治
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Kagawa Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05770193/
• 关键词: Clostridium perfringens; collagenase; metallo protease

1.性状の解析本酵素の性状をアゾコール分解活性を指標に解析した。活性はpH4.5〜9.0の広い範囲で認められ、至適pHはホウ酸バッファーで7.2、リン酸バッファーで7.0であった。至適温度は42°Cであった。10mM CaCl_2存在下で1mMのo-phenanthrolineの添加により完全に阻害された。これらの結果から、本酵素はNeutral metalloproteaseである事が示唆された。酵素標品中の2価金属イオンを、5mM過剰のEDTA添加とSephadex G-10カラムによって除去した後、種々の2価金属イオンを再添加して、金属イオン要求性を調べた。30muMnoZn^<2+>添加によって酵素活性が最も回復したのにたいし、Ca^<2+>では1mM以上の濃度が活性の回復(90%)に必要であった。また、Mg^<2+>では約30%の回復しか得られなかった。以上より、本酵素はZn-proteaseであると結論された。2.産生系の確立本酵素の金属結合部位を特定するためには、部位特異適突然変異導入による解析が有効である。その前段階として、本酵素の大腸菌中での発現系を得る事を試みた。本酵素構造遺伝子をプラスミド上でT3 promorterの下流に連結し、え.coli BL21(pTG119)にtransformした。本菌では、IPTG添加によりT3 RNA polymeraseの発現が誘導され、その結果collagenaseの大量生産が可能なはずである。ところが実際には、IPTGを添加すると菌の増殖が停止し、collagenase活性の誘導は僅かであった。ペリプラスム画分からImmunoblottingによりcollagenase関連抗原を検出を試みると、authentic proteinと同じ分子量の抗原は僅かであり、分子量の小さい抗原が多種多量に観察された。転写または翻訳レベルでの酵素産生の中絶が示唆された。以上の問題を解決するため、本来の宿主であるC.perfringensの持つcollagenase遺伝子(colA)をgene targettingにより除去し、colAを持つplasmidをC.perfringens colA変異株に形質転換する事により、本酵素の構造活性相関に関する詳細な解析を進める予定である。

1. Character "analysis of this enzyme" character "decomposition activity" refers to "analysis of this enzyme". The active pH ranges from 4.5 to 9.0, and the temperature ranges from pH 4.5 to 9.0. The temperature ranges from pH 4.5 to 9.0 to the temperature range of pH. To the temperature of 42 °C at room temperature. In the presence of 10mM CaCl_2, "1mM" o-phenanthroline "add"block" completely "block". The results show that the enzyme Neutral metalloprotease is instigated by this enzyme. In the enzyme label, 2% metal oxide is added, 5mM filter EDTA is added, Sephadex Gmur10 metal filter is added, after removing the temperature, 2% metal alloy is added, and metal metal is required to be added. 30muMnoZn^ & lt;2+> added enzyme activity, the most effective enzyme activity, Ca ^ & lt;2+> enzyme activity above 1mM, activity back (90%). About 30% of the total, mg ^ & lt;2+> prices will be returned to the market. The above enzymes and enzymes are used to Zn-protease the results of experiments. two。 In the department of biology, make sure that the metal binding site of this enzyme has a specific contact area, and that the site is suddenly affected by the enzyme. In the first part of the experiment, this enzyme is used to treat the disease in the fungus. This enzyme is used in the production of T3 promorter, downstream link, coli BL21 (pTG119) and transform. In this bacteria, the addition of T _ 3 RNA polymerase to IPTG showed that the results showed that a large number of bacteria were born in collagenase and may cause severe infection. In the international market, IPTG was added, the colonization of bacteria stopped, and the activity of collagenase led to the termination of bacterial colonization. The molecular weight of Immunoblotting antigens is different from that of authentic protein antigens, and that of small molecular weight antigens is different from that of authentic protein antigens. Write about the instigation of enzymes in the production of enzymes. In order to solve the above problems, the original host C.perfringens held the collagenase virus (colA), the gene targetting filter, the colA, the plasmid, the C.perfringens colA, the enzyme, the enzyme, and the enzyme.