酵母のビタミンB_1代謝に関わる2つの酵素の精製と生化学的解明

酵母中参与维生素B_1代谢的两种酶的纯化和生化阐明

• 批准号: 05780021
• 负责人: 川崎 祐子
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Doshisha Women's College of Liberal Arts
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05780021/
• 关键词: 酵母; ビタミンB_1(チアミン); Thキナーゼ; TMPピロホスホリラーゼ

酵母の増殖はビタミンB_1生合成を阻害する2-アミノヒドロキシエチルチアゾール(NH_2-Th)により阻害される。このNH_2-Thに対する耐性変異株(ATR4)を分離したところ、その粗抽出液中のThキナーゼ(EC2.7.1.50)とチアミン-リン酸ピロホスホリラーゼ(TMP-PPase,EC2.5.1.3)の活性が共に著しく低下しており、遺伝解析により本変異が単一の核性遺伝子の劣性変異であることを確認した。そこで、両酵素の同一性を検討するため親株(IFO 10483)より精製を試みた結果、DEAE、ヒドロキシアパタイト、ゲル濾過クロマトグラフィーの各段階にわたって両酵素が共精製され、最終標品の比活精度はThキナーゼで1445倍、TMP-PPaseで1890倍に上昇した。精製酵素はSDS-PAGE上ほぼ均一のバンド(60kDa)を示し、ゲル濾過法による分子質量(470kDa)より同一のサブユニットから成る8量体の機能酵素であることが推定された。酵母のTMP-PPaseの精製はすでになされているが(Leder,1970)、Thキナーゼについては今回が初めての報告となる。本精製酵母の至適pHはThキナーゼで9.1、TMP-PPaseで7.7であった。Thキナーゼ活性のKm値はThに対して5.7muM、ATPに対して0.79mM、NH_2-Thに対するKi値は2.1muMと測定された。Thキナーゼ反応のヌクレオチドおよび2価金属イオンに対する要求性は、それぞれ比較的広い特異性を示したものの、生理的条件下においてはATPとMg^<2+>が反応に関わっていることが推定された。また本精製酵素の安定性については、pH7.5で50℃30分の過熱処理により両酵素活性の失活の程度に差はみられなかった。

Yeast growth in the production of B_1 inhibition of the 2-way traffic control (NH_2-Th) inhibition The activity of TMP-PPase (EC2.5.1.3) in the crude extract of the NH_2-Th-resistant mutant (ATR4) was determined to be lower than that in the crude extract (EC2. 7. 1. 50). Therefore, the identity of the enzyme was investigated and the results of purification trials with the parent strain (IFO 10483) showed that DEAE, Durocosta, and Geral Filter were co-refined at each stage. The specific activity accuracy of the final standard product was 1445 times higher than that of Thnakai and 1890 times higher than that of TMP-PPase. The purified enzyme showed a uniform molecular weight (60kDa) on SDS-PAGE and a molecular weight (470kDa) by filtration method. The purification of TMP-PPase from yeast is reported in this paper (Leder,1970). This refined yeast has a pH of 9.1 and a TMP-PPase of 7.7. The Km value of Th ~+ is 5.7muM, the Ki value of ATP ~+ is 0.79mM, and the Ki value of NH_2 ~+ is 2.1muM. In the case of the reverse reaction, the ATP and Mg^<2+> are expected to be higher than those of the reverse reaction. The stability of the purified enzyme was determined by the degree of inactivation of the enzyme after overheating at 50℃ for 30 min at pH 7.5.

项目成果

川崎 祐子: "Copurification of hydroxyethylthiazole kinase and thiaminephosphate pyrophosphorylase of Saccharomyces cerevisias:Characterization of hydroxyethylthiazole kinase as a bifunctional enzyme in the thiamine biosynthetic pathway." Journal of Bacteriolo

Yuko Kawasaki：“羟乙基噻唑激酶和酿酒酵母磷酸硫胺素焦磷酸化酶的共纯化：羟乙基噻唑激酶作为硫胺素生物合成途径中双功能酶的表征。”