脊髄一次求心性線維投射路形成の分子機構についての培養法を用いた解析

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脊髄一次求心性軸索の投射路形成における細胞接着分子の役割を明らかにするための実験系として凍結培養法(cryoculture)を確立し、この系を用いて投射路形成におけるNeuron-gila cell adhesion molecule (Ng-CAM)の役割を調べた。材料としては一次求心性軸索が専ら白質を走行する孵卵5日と、この軸索が白質から灰白質に侵入する孵卵9日のニワトリ胚を用いた。ニワトリ胚から脊髄を取り出して凍結切片を作成し、予めpoly-L-lysineをコートしておいたカバースリップ上に貼付けた。次に、トリプシン処理により単離した脊髄神経節細胞を、凍結切片を貼付けたカバースリップ上で分離培養した。1-3日後にパラフォルムアルデヒドで固定し、神経細胞に特異的なbeta-tubulinに対する抗体を用いて脊髄神経節細胞とそこから伸び出す神経突起を染めだして、この突起の走行を調べた。孵卵5日の脊髄凍結切片周辺に存在する神経節細胞から脊髄切片にむかって伸びる神経突起のほとんどは脊髄白質を走行した。それに対し、孵卵9日の脊髄切片上では約半数の神経突起が白質から灰白質に侵入した。これらの走行は生体における一次求心性軸索の走行に類似していた。培地にNg-CAMに対する機能阻害抗体を加えると、孵卵5日の脊髄白質から灰白質へ侵入する神経突起の割合が増加した。しかし、抗Neuron cell adhesion molecule (NCAM)抗体を加えた場合にはこのような増加は見られなかった。生体内でのNg-CAMの分布を考えると、孵卵5日で一次求心性軸索が脊髄白質を走行して灰白質には侵入しない現象に、この時期の白質に多く存在するNg-CAMが関与することが示唆された。