酵素の基質認識性及び反応性に及ぼす糖鎖の影響

糖链对酶的底物识别和反应活性的影响

• 批准号: 05750715
• 负责人: 寺嶋 正明
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05750715/
• 关键词: イネalpha-アミラーゼ; 糖タンパク質; 熱安定性; 酵素; 基質認識

イネalpha-アミラーゼのアイソザイムの一つである。RAmy1Aは酵素活性部位近傍に1ケ所糖鎖結合部位を有している。本研究ではRAmy1Aの糖鎖結合部位を改変した変異体をgapped duplex法を用いて遺伝子工学的に作製した。野生型酵素及び変異体酵素を酵母を用いて分泌生産し、免疫アフィニティ吸着体を用いて精製した。精製した酵素を用いてその反応動力学的特性を検討した結果以下のような結論を得た。1)糖鎖を除くことにより熱安定性が著しく低下した。たとえば80℃で処理した場合、野生型は20分後でも初期活性の50%近い活性を維持するのに対して、変異体では5分後に10%の活性しか示さなかった。この結果は糖鎖の存在が酵素の安定性に重要な働きを持っていることを示唆している。2)可溶性デンプンに対するミハエリス定数(Km)の温度依存性を比較検討した結果、野性型の酵素は強い温度依存性を示すのに対して変異体酵素は一定値を示した。この結果は糖鎖が酵素の基質認識特性に強い影響を及ぼしていることを示唆している。また、最大反応速度(Vm)についても野生型の方が大きな値を示した。アミノ酸配列の相同性の高いタカアミラーゼの3次元構造図をもとにすると、RAmy1Aの糖鎖結合部位は活性部位近傍のタンパク質表面に存在していると考えることができる。従って、上の2)で述べた結果は酵素の糖鎖と高分子の基質である可溶性デンプンの相互作用の有無によるものと考えることができる。この結果は遺伝子操作的に糖鎖結合部位の付与や削除によって、基質認識性などの酵素の反応特性を改変できることを示唆しており、工学的にも興味深い。

イネalpha-アミラーゼのアイソザイムの一つである. The enzyme active site of RAmy1A is close to the sugar-locked binding site of RAmy1A. In this study, the glycol-lock binding site of RAmy1A was modified and the allogeneic gapped duplex method was used, which was fabricated using the method developed by Ishiko Engineering. Wild-type enzymes and allogeneic enzymes are secreted and produced by yeast, and immune enzymes are purified by sorbent. The following conclusions were drawn from the characteristics of the reaction kinetics of the purified enzyme using the enzyme. 1) The sugar lock is removed and the thermal stability is reduced. When it is treated at 80℃, the wild type will be active at nearly 50% of the initial activity after 20 minutes. The sex is maintained and the allogeneic condition is 10% active after 5 minutes. The result is the presence of sugar locks and the stability of the enzyme is important. 2) Comparison of the temperature dependence of the soluble デンプンに対するミハエリスdefinite number (Km) As a result, wild-type enzymes have strong temperature dependence, which means they have a certain temperature dependence on allogeneic enzymes. The result is that the matrix of the glycolytic enzyme has a strong influence on the properties of the enzyme and the properties of the enzyme.また, maximum reaction speed (Vm) についてもwild type のsquare が大きな値をshow した.アミノAcid arrangement の高いタカアミラーゼの3-dimensional structure図をもとにすると、RAmy1 The active site of A's sugar lock binding site is close to the surface of the polypeptide.従って、上の2) The result of the description is the sugar lock of the enzyme and the matrix of the polymer Soluble デンプンの无用によるものと卡えることができる. The result of the operation is the addition and removal of the sugar lock binding site, and the visibility of the matrix. The reaction properties of the enzyme are improved, and the engineering interest is deep.