タンパク質リフォールディングの効率化に関するプロセス工学的検討

大腸菌で異種タンパク質を高濃度に発現させた場合には不溶性固体であるインクルージョンボディが形成されるため、活性のあるタンパク質を得るためには変性・可溶化した後にタンパク質を巻き戻すリフォールディング操作が必要となる。このリフォールディング操作の効率が低いことが、大腸菌での異種タンパク質発現系の大きな問題となっている。本研究ではこの問題にプロセス工学的立場から取り組み、以下に示すような結果を得、プロセス工学的工夫によりリフォールディング操作の効率化・連続化が可能であることを示した。(1)回分操作において、リゾチーム濃度が1μMの時には45分程度で100%活性が回復するが、20μM程度になると80%の回復率に低下した。また、タンパク質濃度を低濃度から段階的に20μMに増加させた場合には一段階でおこなうよりもリフォーディング効率(活性回復率)はむしろ低下した。(2)リゾチーム濃度の増加とともに活性回復率は徐々に減少し、85μMでは40%程度の値となった。また、リゾチーム濃度が70μM以上になると急激にアグリゲーションの割合が増加することがわかった。(3)変性したリゾチームを再活性化液に混合後、ガラスビーズを充填したカラムに流す形式の連続式リフォールディング装置を考案し、回分操作と比較した。その結果、47-75μMといった高いリゾチーム濃度でも回分法と同様な活性回復率で操作ができることを明らかにした。この装置では連続操作が可能であるため、リフォールディング操作終了後連続的に分離精製工程に接続することもできリフォールディングプロセスの効率化をはかれると期待できる。本研究ではプロセス工学的検討がタンパク質のリフォールディング効率の向上に極めて有効であることを実証できた。タンパク質の特性に応じた装置・操作法を選択することで種々のタンパク質のリフォールディング効率を上げ得ると期待できる。

大腸菌で異種タンパク質を高濃度に発現させた場合には不溶性固体であるインクルージョンボディが形成されるため、活性のあるタンパク質を得るためには変性・可溶化した後にタンパク質を巻き戻すリフォールディング操作が必要となる。このリフォールディング操作の効率が低いことが、大腸菌での異種タンパク質発現系の大きな問題となっている。本研究ではこの問題にプロセス工学的立場から取り組み、以下に示すような結果を得、プロセス工学的工夫によりリフォールディング操作の効率化・連続化が可能であることを示した。(1)回分操作において、リゾチーム濃度が1μMの時には45分程度で100%活性が回復するが、20μM程度になると80%の回復率に低下した。また、タンパク質濃度を低濃度から段階的に20μMに増加させた場合には一段階でおこなうよりもリフォーディング効率(活性回復率)はむしろ低下した。(2)リゾチーム濃度の増加とともに活性回復率は徐々に減少し、85μMでは40%程度の値となった。また、リゾチーム濃度が70μM以上になると急激にアグリゲーションの割合が増加することがわかった。(3)変性したリゾチームを再活性化液に混合後、ガラスビーズを充填したカラムに流す形式の連続式リフォールディング装置を考案し、回分操作と比較した。その結果、47-75μMといった高いリゾチーム濃度でも回分法と同様な活性回復率で操作ができることを明らかにした。この装置では連続操作が可能であるため、リフォールディング操作終了後連続的に分離精製工程に接続することもできリフォールディングプロセスの効率化をはかれると期待できる。本研究ではプロセス工学的検討がタンパク質のリフォールディング効率の向上に極めて有効であることを実証できた。タンパク質の特性に応じた装置・操作法を選択することで種々のタンパク質のリフォールディング効率を上げ得ると期待できる。