真核生物におけるチアミン・ピリミジン部の生合成経路の酵素化学的解析

真核生物硫胺素和嘧啶部分生物合成途径的酶化学分析

• 批准号: 05857263
• 负责人: 村山 恵子
• 金额: $ 0.45万
• 依托单位: Mukogawa Women's University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05857263/
• 关键词: チアミン; チアミン・ピリミジン部; ピリドキシン; ヒスチジン; Saccharomyce scerevisiae

酵母を合成培地で培養し、培養後菌体をフレンチプレスで圧縮破砕した。菌体破砕液を遠心分離を行い、上清液と沈殿とに分離した。上清液を粗精製するため硫酸アンモニウムによる分画を行った。硫酸アンモニウム0-65%飽和の画分を粗酵素液とした。この粗酵素液を用いて酵素反応を行った。反応系にはチアミン・ピリミジン部の前駆体であるヒスチジンとピリドキシン、さらにATP、マグネシウムイオンを添加して行った。反応生成物であるチアミン・ピリミジン部の液体クロマトグラフィーによる微量定量を行うため、ピリミジン部の蛍光化を検討した。しかし、ピリミジン部の蛍光化条件を決定できなかった。このピリミジン部の蛍光化については現在も検討中である。ピリミジン部の微量定量が困難であるため、反応系にチアゾールモノリン酸も加えて、生成したピリミジン部と反応させ最終的に生成するチアミンをチオクローム蛍光法を用いてHPLCで定量した。上記の方法で実験を行い次のような結果を得た。1 ヒスチジン、ピリドキシン、チアゾールモノリン酸を基質としてチアミンが生成され、ピリミジン部の前駆体がヒスチジン、ピリドキシンであることが酵素化学的に証明された。2 粗酵素液での条件ではあるが、至適pH7.2、至適温度38℃、反応系にATP、マグネシウムイオンが要求されること、SH基保護剤の影響は受けないこと等を明らかにしアッセイ方法を確立した。基質として、ピリドキシン、ピリジキサミン、ピリドキサル、ピリドキサミンリン酸、ピリドキサルリン酸を用いて反応を行ったところピリジキサル、ピリドキサルリン酸がピリドキシンよりチアミン生成の効率が良いため、ピリミジン部の直接の前駆体はピリドキシンではなくピリドキサルまたはビリドキサルリン酸であることを明らかにした。

Yeast is cultured in synthetic soil, and the cultured cells are broken by pressure and shrinkage. The bacterial cells were broken into liquids and separated by centrifugal separation, and the supernatant was separated by centrifugal force. The supernatant was crudely refined and separated into sulfuric acid ammonium sulfate. Sulfuric acid ammonium sulfate 0-65% saturated crude enzyme solution. The crude enzyme liquid is reacted with the enzyme enzyme. Anti-reflection system にはチアミン・ピリミジン部の前槆体であるヒスチジンとピリドキシン, さらにATP, マグネシウムイオンをadd して行った. Reaction product であるチアミン・ピリミジン部の Liquid クロマトグラフィーによるMicro-quantitative を行うため, ピリミジン部の蛍光化を検した.しかし、ピリミジン部の蛍Photochemical conditionsをdetermineできなかった.このピリミジン部の蛍光化についてはNow I'm talking about the middle である.ピリミジン部の微quantitative difficultyがであるため, reaction system にチアゾールモノリンacid もplusえて, generated したピリThe final result of the reaction of the Mizuno Department was the light generation method of the Mizuno HPLC, which was quantified by HPLC. The method mentioned above is the same as the result. 1ヒスチジン、ピリドキシン、チアゾールモノリン acid を matrix としてチアミンが generates され、ピリミジン部の前槆体がヒスチジン, ピリドキシンであることがにproven enzyme chemistry. 2 The conditions of the crude enzyme solution are: optimum pH 7.2, optimum temperature 38°C, reaction system ATP, マグネシウムイThe influence of けないこと and other を明らかにしアッセイ method has been established due to the influence of けないこと and other オンが requirements. Base として, ピリドキシン, ピリジキサミン, ピリドキサル, ピリドキサミンリン acid,ピリドキサルリンを Use いててサボを行ったところピリジキサル, ピリドキサルリン acid がピリドキシンよりチアミンGeneration efficiencyが好いため、ピリミジン部のDirectの前槆体はピリドキシンではなくピリドキサルまたはビリドキサルリン acid であることを明らかにした.