1) Structure/Function analysis of myosins and micronemal proteins: as potential invasion factors of Toxoplasma gondii 2) Development of a regulated gene expression system

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Wirtszellinvasion ist der erste erforderliche Schritt für dieEtablierung einer Infektion durch Apicomplexa. Die sog."gleitende Beweglichkeit" ist hierbei Grundvoraussetzung und wird durch das Aktomyosin-System des Parasiten angetrieben. Um die Mechanismen der Invasion auf molekularer Ebene zu entschlüsseln, haben wir Myosine aus T. gondii kloniert und in ihren Grundzügen charakterisiert. Durch Methoden der reversenGenetik wurden grundlegende Informationen über die subzellu- läre Lokalisierung dieser Motoren erhalten. Zwei Myosine (MyoAund MyoD) lokalisieren exakt unterhalb der Plasmamembran des Parasiten und wären in einer idealen Position, mechanische Energie zu übertragen und so Gleiten und Zellinvasion anzu- treiben. Weiterhin haben wir ein nahe verwandtes Homolog dieser beiden Myosine aus Plasmodium falciparum charakterisiert. Unsere Ziele sind nun, zu bestimmen, welche bzw. welches dieser Myosine in die "gleitende Beweglichkeit" involviert sind bzw. ist, und ihre Funktionsweise zu bestimmen. Auf der Suche nach Partnern von Myosinen während des Invasionsprozesses haben wir eine neue Familie von transmembranen, mikronemalen Proteinen aus T. gondii entdeckt und näher charakterisiert. Diese werden zum Zeitpunkt der Invasion ausgeschüttet und weisen homologe Domänen mit Proteinen auf, welche aus anderen Mitgliedern des Stammes Apicomplexa beschrieben wurden. Diese Beobachtung unterstützt die Vorstellung eines gemeinsamen molekularen Mechanismus der Wirtserkennung, -anheftung und -invasion in diesem Stamm. Die mikronemalen Proteine setzen sich aus Modulen zusammen, die auf verschiedene Weise kombiniert werden können, dadurch wird deren Komplexität erhöht. Adhäsive Domänen wie das TSP-verwandte Motiv (Thrombospondin), die A-Domäne (Integrine), die EGF-like Domäne (Notch, Fibrillin), die Apple-Domäne (Kallikrein, Faktor XI) lassen sich in einer großen Anzahl in Proteinen höherer Eukaryoten finden, dort sind diese Proteine in Protein-Protein Wechselwirkung oder Zell-Zell Interaktion involviert. Diese Motive sind in variierender Anzahl und Kombination, mit oder ohne transmembrane und cytoplasmatische Domäne, in Proteinen der Apicomplexa vorhanden. Die Bedeutung dieses modularenBaukastensystems ist noch nicht geklärt. Zusätzlich sind einige dieser Proteine stark antigenisch und stellen somit potentielle Vakzinkandidaten dar. Durch Charakterisierung des genomischen Lokus, Produktion spezifischer Antikörper gegen unterschiedliche Domänen der Proteine und Generierung von KO-Mutanten haben wir in letzterZeit die nötigen Werkzeuge geschaffen, um die Funktionen dieser beiden potentiellen Klassen von Invasionsfaktoren nun näher bestimmen zu können. Zur Untersuchung der Biogenese, Lokali- sierung, Prozessierung und Sortierung dieser neuen Proteine wurden auch Ansätze der reversen Genetik verwendet, wie Deletionen, ortsspezifische Mutationen und GFP Fusionskon- strukte. Das Fehlen eines Systems zur kontrollierten Gen- expression in Apicomplexa behindert immer noch die Untersuchung der Funktion essentieller Gene. Es ist offensichtlich, daß einsolches System mit zu den Voraussetzungen einer Untersuchung der Invasion mit Hilfe von gentechnischen Methoden in vivo gehören würde. Modifikationen der bisherigen Ansätze und Untersuchung neuer Strategien werden auf die Entwicklung eines solchen Systems abzielen.