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培養結膜細胞におけるRespiratory Syacytial Virus(RSV)感染および抗原感作によるTh_2様サイトカインの産生について

呼吸道综合征病毒（RSV）感染和培养结膜细胞中抗原致敏产生Th_2样细胞因子

基本信息

批准号：
06771547
负责人：
藤島浩
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Tokyo Dental College
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06771547/
关键词：
アレルギー性結膜炎 RSV 結膜上皮細胞 IL-4 classII抗原 antisence

项目摘要

アレルギー性結膜炎の臨床所見と自覚症状がなく、MAST法により特異的IgE抗体陰性であった正常人10人の結膜からブラッシュサイトロジー法(細胞診用のブラシを眼科用に小さく細工したブラシ)によって結膜上皮細胞を採取し、一部をRT-PCR法にてRSVの発現のないことを確かめた後、培養液中で1週間上皮培養した。培養液はHams F12:Dulbecco's MEM(1:1),15%FCS,0.5%DMSO,40μl/mlゲンタマイシン,5μg/mlインスリン、0.1μh/mlコレラトキシンを含む培養液中で増殖させる(予備実験にてEGFを添加すると細胞の文化が進んでしまうことが確認されているので添加しない)。容器は8穴Labtec Chamberを使用し、37℃、5%CO_2Incubator内で7日間培養した。20℃、800回転20分遠沈、培養液で3回洗浄し、混在するリンパ球などを除去して上皮細胞のみとした。その後、96穴プレートに移してRSVを加えて24、28および72時間培養し同様に遠沈した。ペレットの一部はclassII抗原の発現をFAXで検討した結果感染により発現を認めた。また一部は4℃アセトンで固定後抗RSV抗体染色を行い非感染例との上皮への染色性を比較検討し、感染により上皮細胞中に陽性所見を認め、さらにRT-PCRにてRSVの発現を確認した。培養上清はsandwich ELISAにてIL-4の産生を定量した。感染後IL-4濃度は4.7±4.1(1日)、3.6±1.1(2日)、5.4±1.8pg/ml(3日)であったが非感染例では0.3pg/ml以下であった。以上のデータは1995 Association for research in vision and ophthalmology(ARVO)にて発表予定であり、現在anti-RSV antisenceを同時に投与しを3日間感染培養した場合の染色性やIL-4の産生について検討中であり、また上清はELISA法で可溶性、組織結合性IgE産生量を定量する予定であり、データがでたところで論文投稿予定である。

The clinical findings of conjunctivitis were self-reported symptoms, MAST method, specific IgE antibody negative, and 10 normal subjects. Conjunctival epithelial cells were collected by MAST method, and RSV development was confirmed by RT-PCR method. Epithelial culture was carried out in culture medium for 1 week. The culture medium was Hams F12:Dulbecco's MEM(1:1),15%FCS,0.5%DMSO,40μl/ml EGF, 5 μg/ml EGF, 0.1μh/ml EGF and culture medium. 8-hole Labtec Chamber, 37℃, 5%CO_2 Incubator, 7 days incubation 20℃, 800 ℃, 20 min precipitation, 3 times washing of culture medium, mixing of medium, removal of epithelial cells, After 96 hours, the RSV was added to the culture for 24 hours, 28 hours and 72 hours. A part of classII antigen discovery FAX search results in infection discovery In addition, anti-RSV antibody staining was performed after fixation at 4℃ to compare the staining properties of non-infected cases and epithelial cells, to confirm positive findings in infected epithelial cells, and to confirm the detection of RSV by RT-PCR. Production of IL-4 in culture supernatant by sandwich ELISA IL-4 concentrations after infection were 4.7±4.1(1 day), 3.6±1.1(2 days), and 5.4± 1.8 pg/ml(3 days). The 1995 Association for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO) has proposed a method for determining the production of soluble and tissue-bound IgE by ELISA.