コケイン症候群A群原因遺伝子のクローニング

克隆导致 Cockayne 综合征 A 组的基因

• 批准号: 06780436
• 负责人: 綾木 仁
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780436/
• 关键词: コケイン症候群; A群原因遺伝子; クローニング; cDNA発現ライブラリー

正常ヒト線維芽細胞、NIKAよりグアニジンチオシアネート法により全RNAを抽出し、オリゴdTを用いてmRNAを分離後、cDNA合成を行った。得られたcDNAを真核生物発現用ベクターpRC/RSV(ネオマイシン耐性遺伝子を含む)に導入し、cDNAライブラリーを作成した。このライブラリーは、cDNAの平均サイズが、1.2kbpで、70万の独立したクローンを含んでいた。このライブラリーをコケイン症候群A群細胞株、CS2OSSVにリポフェクション法を用いて導入した。得られた約12万のネオマイシン耐性コロニーを紫外線照射により選択したところ5コロニーが生き残った。これらのコロニーの生存率曲線を調べたところ、4コロニーはCS2OSSVと同程度か、若干耐性を示す程度であったが、1コロニーは正常細胞と比較して半分から2/3程度の回復を示した。この細胞からゲノムDNAを抽出し、ネオマイシン遺伝子をプローブとしてサザンブロット解析を行ったところ1本のバンドが検出された。そこで、cDNAの外側のベクター部分にプライマーを設定し、ゲノムDNAを用いてPCRを行ったところ単一バンドが検出された。次に、このDNAの塩基配列をダイデオキシ法を用いて決定したが、ベクターのみの配列で、cDNAは含まれていなかった。従って、この紫外線耐性細胞は、自然復帰突然変異体であり、目的とするcDNA導入により回復した細胞ではないことが判明した。今回使用した発現ベクターpRC/RSVは、ゲノムに組み込まれるタイプである。最近EBウイルスの複製開始点oriPを含む発現ベクターがEBNA遺伝子の発現している細胞では高効率に導入され、しかもプラスミドの状態で複製することを利用した遺伝子の単離が報告された。本研究においてもこの方法を導入すべく、現在EBNA遺伝子の発現したCS2OSSV株を樹立し、oriPを持つ発現ベクターを用いてcDNAライブラリーの作成を行っている。

Normal ヒ ト line d bud cells, NIKA よ り グ ア ニ ジ ン チ オ シ ア ネ ー ト method に よ り total RNA を drew し, オ リ ゴ dT を with い て mRNA を line after separation, cDNA synthesis を っ た. Have to ら れ た cDNA を eukaryotes 発 current ベ ク タ ー pRC/RSV (ネ オ マ イ シ ン patience but 伝 son を む) に import し, cDNA ラ イ ブ ラ リ ー を made し た. こ の ラ イ ブ ラ リ ー は, cDNA の average サ イ ズ が, 1.2 KBP で, 700000 の independent し た ク ロ ー ン を containing ん で い た. <s:1> ラ ブラリ ブラリ をコケ をコケ をコケ <s:1> syndrome group A cell line, CS2OSSVにリポフェ ショ ショ <s:1> method を introduce た た with を て. Have ら れ た about 120000 の ネ オ マ イ シ ン patience コ ロ ニ ー を ultraviolet irradiation に よ り sentaku し た と こ ろ 5 コ ロ ニ ー が raw き residual っ た. こ れ ら の コ ロ ニ ー の survival curve を adjustable べ た と こ ろ, 4 コ ロ ニ ー は CS2OSSV と か with degree and some patience を で す degree あ っ た が, 1 コ ロ ニ ー は normal cells と compare し て half か ら two-thirds degree の reply を shown し た. こ の cells か ら ゲ ノ ム を DNA extraction し, ネ オ マ イ シ ン heritage 伝 son を プ ロ ー ブ と し て サ ザ ン ブ ロ ッ ト parsing line を っ た と こ ろ this の バ ン ド が 検 out さ れ た. そ こ で, cDNA の lateral の ベ ク タ ー part に プ ラ イ マ ー を set し, ゲ ノ ム を DNA with い PCR line を っ て た と こ ろ 単 a バ ン ド が 検 out さ れ た. に, こ の DNA の salt base with column を ダ イ デ オ キ を シ method with い て decided し た が, ベ ク タ ー の み の column で, cDNA contains は ま れ て い な か っ た. は 従 っ て, こ の ultraviolet patience cells, natural compound 帰 suddenly - variant で あ り, purpose と す る cDNA import に よ り reply し た cells で は な い こ と が.at し た. This time, た た was used to produce ベ タ タ た pRC/RSV プである and ゲノムに groups み込まれるタ プである プである. Recently EB ウ イ ル ス の copy starting point oriP を containing む 発 now ベ ク タ ー が EBNA posthumous son 伝 の 発 now し て い る cells で は high working rate に import さ れ, し か も プ ラ ス ミ ド の state で copy す る こ と を using し た heritage 伝 son の 単 report from が さ れ た. This study に お い て も こ の way を import す べ く, now EBNA but 伝 の 発 now し た CS2OSSV strains を し, oriP を hold つ 発 now ベ ク タ ー を with い て cDNA ラ イ ブ ラ リ ー の made line を っ て い る.