高濃度塩とプロ配列によるサチライシンの高次構造形成誘導メカニズムの解明

阐明高浓度盐和前序列诱导枯草杆菌蛋白酶形成高级结构的机制

• 批准号: 06780540
• 负责人: 栗本 英治
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Nagoya City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780540/
• 关键词: サチライシン; 高濃度塩; プロ配列; リフォールディング

Subtilisin BPN'の高次構造形成にはプロ配列が必須とされていたが、最近、我々は2Mという高濃度の酢酸塩が非常に有効にプロ配列を持たないsubtilisinのrefoldingを誘導することを見いだし、酢酸塩と正負の電荷が偏って集まる部分を持つプロ配列それぞれの作用機序に何らかの共通点があるのではないかと考えた。本研究では、分子間の相互作用が無視でき試薬の効果が判定しやすい固定化subtilisinを主に用いて、そのrefoldingに対する種々の特徴を持つ塩などの効果を調べた。その結果、カルボキシル基を持つ有機酸塩はすべて各種無機塩より有効であることが認められた。酢酸塩とプロピオン酸塩が最も効果的であり、コハク酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩など複数のカルボキシル基を持つものはやや効果が弱く、アスパラギン酸塩などは無機塩よりやや良い程度であった。またプロピルアミンおよびトリスの塩は全く効果がなかった。このように、カルボキシル基を有し、ある程度の疎水的部分を持つ電荷-1の陰イオンが効果的であること、陽イオンに関しては疎水的部分も含めイオン全体のかさが大きすぎると全く効果がないことが判明し、イオンは部位特異的に作用することが示唆された。カルボキシル基には水素結合能があるが、非イオン性で水素結合を形成しうるものとしてアルコール、ポリオールに効果を調べた結果、45%エチレングリコール(EG)中で比較的効率よくsubtilisinのrefoldingが起こり、必ずしも高濃度塩は必須でないことが明らかとなった。45%EG に 1M LiCl を添加することでrefolding速度は酢酸塩の場合と同程度まで上昇し、EGと塩の加算的効果が確認された。ポリオールにはタンパク質の Native 構造安定化作用があるが、酢酸塩も実際に同様な作用を持つことが認められた。以上より、subtilisinの高次構造形成には、好ましくない静電的相互作用の抑制および高次構造安定化が重要であり、プロ配列はそれらに加えてプロテアーゼ活性を抑制することでsubtilisinの高次構造形成を助けると考えられる。

Subtilisin BPN's higher-order structure formation requires the alignment of the subtilisin BPN's to be maintained at a high concentration of 2M. The alignment of the subtilisin BPN's to be maintained at a high concentration of 2 M. In this study, the effects of molecular interactions on the determination of immobilized subtilisin were investigated. The effects of molecular interactions on the characterization of immobilized subtilisin were investigated. As a result, organic acids are used in various inorganic compounds. The most effective of these is acid, acid. Also, the laptop's connectivity and flexibility are fully effective. For example, if the water content of the water content is low, the water content of the water content of the water content of In addition, the water element binding rate in the group of 45% is higher than that in the group of 45% and the group of 45% is 45% EG and 1M LiCl are added to the solution, and the refolding rate increases to the same extent as in the case of EG and LiCl. The original structure stabilization effect of the compound is not stable, and the reaction of the compound is not stable. The formation of high-order structures in subtilisin is important for the suppression of electrostatic interactions and the stabilization of high-order structures.

项目成果

Mamoru Matsubara: "Achievement of Renaturation of Subtilisin BPN'by a Novel Procedure Using Organic Salts and a Digestible Mutant of Streptomyces Subtilisin Inhibitor." FEBS Letters. 342. 193-196 (1994)

Mamoru Matsubara：“通过使用有机盐和链霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂的可消化突变体的新方法实现枯草杆菌蛋白酶 BPN 的复性。”

Tomoya Sakai: "A Possible Mutation of Streptomyces Subtilisin Inhibitor to Function as an Artificial Chaperon for the Refolding of Subtilisin BPN." Protein Engineering. (in press.).

Tomoya Sakai：“链霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂的可能突变，可作为枯草杆菌蛋白酶 BPN 重折叠的人工伴侣。”