線虫のトランスポゾン挿入突然変異遺伝子の迅速フィジカルマップ法の開発

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トランスポゾンTclの挿入による突然変異遺伝子を迅速にフィジカルマップする方法として、Tcl-ゲノム-コスミドの3分子間ハイブリッド形成による検出と整列化コスミドフィルターを用いる方法を提案した。そこでまず、3分子間ハイブリッドによる検出が可能であるか以下のようなモデル実験により検討した。フィルターにkin-8遺伝子を含むコスミドAとlet-23遺伝子を含むコスミドBを1本鎖化して固定化した。このフィルターをHRPで標識したTclDNAと、EcoRIで断片化したkin-8遺伝子にTcl挿入を持つ突然変異体のゲノムDNA(イ)もしくは野生株のゲノム(ロ)を含む溶液中で一晩保温した後、洗浄し、発光基質と反応させ、X-線フィルム上の感光として検出した(通常のECL(アマシャム社)によるサザンブロットハイブリダイゼーションの操作と全く同様)。結果は、全ての組み合わせ(A-イ、A-ロ、B-イ、B-ロ)でシグナルが検出された。ゲノムDNAイ、ロを入れないとシグナルは出なかった。A-イだけにシグナルが出るはずであったが、他のものにも出てしまった。これは、思いの外、ゲノムDNAには互いに、クロスハイブリダテゼーションする部分があるためだと考えられる。ゲノムDNAイ、ロを入れないとシグナルは出せないことから、3分子間ハイブリドによる検出そのものは成功したものと考えられる。今後の改善策としては、1.加えるゲノムDNAをもっと短く断片化し、クロスハイブリダイゼーションする部分とTclを含む部分が同一のDNA断片上に無いように(もしくはその頻度が低くなるように)する、2.ハイブリダイゼーション、洗浄の条件を厳しくする、3.ラベルするTclDNAの領域を特定のユニークな領域に限る、等が考えられる。3分子間ハイブリッドそのものはうまくいているので、必ずや成功する条件が確立できると考えている。