線虫のトランスポゾン挿入突然変異遺伝子の迅速フィジカルマップ法の開発

线虫转座子插入突变基因快速物理作图方法的发展

• 批准号: 06780615
• 负责人: 古賀 誠人
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06780615/
• 关键词: 線虫; フィジカルマップ; トランスポゾン; クローニング; 突然変異; タッギング

トランスポゾンTclの挿入による突然変異遺伝子を迅速にフィジカルマップする方法として、Tcl-ゲノム-コスミドの3分子間ハイブリッド形成による検出と整列化コスミドフィルターを用いる方法を提案した。そこでまず、3分子間ハイブリッドによる検出が可能であるか以下のようなモデル実験により検討した。フィルターにkin-8遺伝子を含むコスミドAとlet-23遺伝子を含むコスミドBを1本鎖化して固定化した。このフィルターをHRPで標識したTclDNAと、EcoRIで断片化したkin-8遺伝子にTcl挿入を持つ突然変異体のゲノムDNA(イ)もしくは野生株のゲノム(ロ)を含む溶液中で一晩保温した後、洗浄し、発光基質と反応させ、X-線フィルム上の感光として検出した(通常のECL(アマシャム社)によるサザンブロットハイブリダイゼーションの操作と全く同様)。結果は、全ての組み合わせ(A-イ、A-ロ、B-イ、B-ロ)でシグナルが検出された。ゲノムDNAイ、ロを入れないとシグナルは出なかった。A-イだけにシグナルが出るはずであったが、他のものにも出てしまった。これは、思いの外、ゲノムDNAには互いに、クロスハイブリダテゼーションする部分があるためだと考えられる。ゲノムDNAイ、ロを入れないとシグナルは出せないことから、3分子間ハイブリドによる検出そのものは成功したものと考えられる。今後の改善策としては、1.加えるゲノムDNAをもっと短く断片化し、クロスハイブリダイゼーションする部分とTclを含む部分が同一のDNA断片上に無いように(もしくはその頻度が低くなるように)する、2.ハイブリダイゼーション、洗浄の条件を厳しくする、3.ラベルするTclDNAの領域を特定のユニークな領域に限る、等が考えられる。3分子間ハイブリッドそのものはうまくいているので、必ずや成功する条件が確立できると考えている。

A new method for the rapid development of Tcl-3 molecules is proposed The following is a list of possible solutions to the problem: The protein A, B and C were immobilized in the first place. The HRP marker TclDNA, EcoRI fragment, kin-8 gene, TclDNA incorporation, and the presence of mutant DNA in the wild strain in aqueous solution were incubated overnight, washed, and the light-emitting substrate was isolated from the X-ray photosensitizer (normal ECL) and operated in the same manner). The results showed that the total number of groups (A-1, A-2, B-3, B-3) was increased. The DNA of the virus is transmitted from the virus to the virus. A- This is the first time I've ever seen a woman. The first is the first time that a person has ever been involved in a crime. Future improvement measures include: 1. increasing DNA fragmentation, including Tcl DNA fragments, 2. increasing DNA fragmentation, washing conditions, 3. increasing Tcl DNA regions, limiting specific regions, etc. 3. The conditions for success are established.