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光化学系の発現を制御するレドックスセンサーキナーゼに関する研究

控制光系统表达的氧化还原传感器激酶的研究

基本信息

批准号：
06740607
负责人：
井上和仁
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Kanagawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

Rhodobacter capsulatusのセンサーキナーゼRegBの膜貫通領域をカットしたDNA regB'をPCR法で増幅した。この時、T7 RNAポリメラーゼ系のベクターであるpT7-7に組み込むためregB'の5'末端と3'末端にそれぞれ制限酵素NdeIとXhoIの切断部位を導入するようプライマーを設計した。増幅されたregB'をpT7-7に導入し、大腸菌(C600/pGP1-2)にトランスフォーメションさせ、42℃の熱ショックでRegB'を発現させた。大腸菌をフレンチプレスで破壊後、10000gで10分、上清をさらに、39000gで1時間遠心し沈澱にRegB'に富む画分を得た。7M尿素でRegB'を可溶化し、DEAEバイオゲルA、ヒドロキシアパタイトにより精製した。精製されたRegB'はタンパク濃度0.3mg/ml、3M尿素、70mM メルカプトエタノール、5mM MgCl_2で室温30分間インキュベート後、透析で尿素を除きリフォールディングした。なお、全ての操作は嫌気下で行い、溶液は予め脱気後、充分窒素を通したものを用いた。リフォールディングされたRegB'に[γ-^<32>P]ATP、[α-^<32>P]ATP、[γ-^<32>P]GTPを加え室温で20分インキュベート後、SDSゲル電気泳動し、オートラジオグラフィーを行ったところ[γ-^<32>P]ATPを用いた時のみRegB'の自己リン酸化が起こった。次いで、レスポンスレギュレーターRegAをRegB'と[γ-^<32>P]ATPとともにインキュベートしたところ、RegB'に依存したRegAのリン酸化が起こり、センサーキナーゼRegBからレスポンスレギュレーターRegAへの情報伝達がリン酸基の転移によって起こることが確認された。リフォールディングされたRegB'を空気中に曝したり、嫌気下で酸化剤にフェリシアン化カリウムを加えると、RegB'の自己リン酸化能は失われた。また、フェリシアン化カリウムをカラム遠心で除去後、嫌気下でDTTとインキュベートするとRegB'の自己リン酸化能の回復が見られたので、RegB'はin vitroでも酸化還元状態を認識していることが解った。

The Rhodobacter capsulatus system is sensitive to the RegB film. The field is clear. The DNA regB' PCR method is used to determine the amplitude of the film. At the same time, the T7 RNA device was operated on the pT7-7 device. The enzyme restriction enzyme NdeI in the 3 'end of the 5' end of the NdeI was recorded in the XhoI section of the 5 'end of the device. RegB' pT7-7, C600/pGP1-2, C600/pGP1-2, 42 ℃, 42 ℃, RegB'. After the bacteria were damaged, 10000g