シリンギルリグニン生成に関与するペルオキシダーゼのcDNAクローニング

紫丁香基木质素生产中涉及的过氧化物酶的 cDNA 克隆

• 批准号: 06760162
• 负责人: 堤 祐司
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Shizuoka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06760162/
• 关键词: Lignin; Sinapyl alcohol; Coniferyl alcohol; Peroxidase; Substrate Specificity

ポプラ若枝の形成層を含む細胞をTris-HCl緩衝液(50mM,pH7.5)と共にホモジナイズし、可溶性ペルオキシダーゼ画分(SPO)を抽出した後の細胞壁残渣からNaClおよびCaCl_2の濃度を変えて細胞壁にイオン的に結合したペルオキシダーゼ画分(IPO)の抽出を行った結果、0.6 M NaClを用いた場合が最も抽出効率が高く、酵素活性が長期間安定であることが明らかとなった。IPO画分からシリンギル核に特異性が高いペルオキシダーゼを単離する目的で、イオン交換クロマトグラフィーを行ったが、目的とするペルオキシダーゼは希薄な塩溶液中ではきわめて不安定であり、イオン交換クロマトグラフィーによる分画は不可能の判断した。また疎水クロマトグラフィーでは、酵素活性が安定に保持できる塩濃度では吸着が起こらないことから、目的アイソザイムは疎水性が低く、大きな糖鎖を有していることが予想された。ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて分取したIPO画分の主要ペルオキシダーゼはSPO画分と比べてシナピルアルコール高い特異性を示し、その分子量は約38,000と推定された。しかしながら完全な精製にはいたらなかったため、cDNAスクリーングのための抗体作成には用いることはできなかった。この画分のNativeアニオンPAGEを行った結果、全く泳動されなかったことから、シナピルアルコールに特異性の高いペルオキシダーゼはカチオン性と予想された。一方、ポプラカルスを用いてmRNAの抽出、cDNAの合成、ベクターへのライゲーション、ホストセルへの導入等の条件を詳細に検討し、最適条件を用いてcDNAライブラリー作成し、一次スクリーニングを行った。現在、樹木ペルオキシダーゼのcDNAライブラリー作成と、ポプラカルスより単離したシリンギル核特異的ペルオキシダーゼのシークエンスを元に合成プローブを作成しスクリーニングを進めている。

Tris-HCl buffer solution for the cambium layer containing cells (50mM, pH7.5) and soluble protein fraction (SPO) after extraction of cell wall residue, NaCl and CaCl_2 concentration change of cell wall protein fraction (IPO) extraction results, 0.6M NaCl in the case of the highest extraction efficiency. Enzyme activity is stable for a long time. IPOs are divided into two groups: one group is high in nuclear specificity, the other group is high in nuclear specificity, The enzyme activity is stable, the concentration is stable, the adsorption is stable, the target is stable, the water content is low, the sugar content is stable, and the enzyme activity is stable. The molecular weight of the sample is estimated to be about 38,000. A complete and precise system of cDNA is used in the production of antibodies. The results of Native PAGE analysis showed that the total migration was different from that of the total migration, and the specificity was higher than that of the total migration. The conditions of mRNA extraction, cDNA synthesis, cDNA synthesis, cDNA introduction, etc. were discussed in detail, and the optimal conditions were created by cDNA synthesis. Now, the tree selection process of the cDNA library is completed, and the selection process of the cDNA library is completed.