せん断応力を受けた培養内皮細胞が示すF-アクチンフィラメントの動的反応過程の解析

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ウシ大動脈由来の血管内皮細胞をカバーガラス上に培養し、顕微鏡下でコンフル-エントになったことを確認した後、まず、細胞に色素を取り込ませる穴をあけるため、サポニン処理(0.5mg/mlの濃度でハンクス平衡塩類溶液に溶解した)を20分間施した。その後、150nMの濃度のロ-ダミンファロイジンに20分間浸し、細胞が生きたままの状態でアクチンフィラメントを染色した。この細胞を平行平板型フローチャンバにセットし、蛍光顕微鏡で観察を行いながら、2Paの定常的なせん断応力を負荷した。平行平板型フローチャンバには、10%牛胎児血清と蛍光色素の褪色防止剤であるn-プロピルガレート(0.01g/ml)を混ぜたダルベッコ改変イ-グルメディウムを灌流させた。観察と同時に高感度ビデオカメラで撮影を行い、ビデオテープに映像を記録した。1時間にわたって実験を行った結果、一部のアクチンフィラメントが徐々に成長する様子が観察されたが、流れの方向への配向などは観察されなかった。サボニン処理により、細胞を固定化せずにアクチンフィラメントを染色し、せん断応力を受けた血管内皮細胞のアクチンフィラメントの動的な反応過程の解析が可能であることは確認できた。しかし、蛍光色素であるロ-ダミンファロイジンが蛍光顕微鏡で観察中に褪色してしまい、長時間にわたった観察が不可能であるため、今後、高感度ビデオカメラをとおした映像の記録方法などを改善し、アクチンフィラメントの動的な反応過程を詳細に観察する予定である。