ウリカーゼ遺伝子cAMP応答領域に結合する新たな転写調節因子のクローニング

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前年度までの実験結果から得られたウリカーゼ遺伝子のcAMP応答領域は、400bpという長い範囲にわたっており、蛋白質結合領域との機能的な関連づけが不明瞭であった。そこで、cAMP応答領域をより短い範囲に限定するため、新たに数種類のCATレポータープラスミドを作製し、CATアッセイを行った。その結果-169から-86の84bpがcAMP応答性に関与していることが明らかになった。さらに、この84bpを、既に蛋白質の結合が確認できている上流側の30bp(-169から-140)と、それ以外の下流側の大部分をカバーする61bpの制限酵素断片(-155から-95)にわけ、それぞれをプローブにゲルシフトアッセイを行った。結果として、61bp断片には蛋白質は結合しないことがわかった。これらの実験結果からウリカーゼ遺伝子のcAMPによる転写促進には-169から-140の30bpが関わっていることを、より明確に示すことができた。(第67回日本生化学会大会にて発表)。この30bpに結合する転写調節因子の遺伝子をクローニングするためには、蛋白質結合のコアになっている領域を決定する必要がある。また、結合蛋白質が既知のCREB(cAMP response element binding protein)とは異なることを確認しておくことも必要である。実験計画に基づき、DNaseIフットプリントを行ったが、有効な結果が得られなかった。そこで、数種類の欠失プローブを作製してゲルシフトアッセイを行い、コア領域の決定を試みた。その結果、-164から-155(GAAAAATGTC)の領域がコアになっていることがわかった。次に、実験計画に基づき、CREB抗体を用いたゲルシフトアッセイを行ったが、市販の抗体はポリクローナルであるため、有効な結果は得られなかった。しかし、CRE配列とCREBとのコンプレックスは、30bpと未知蛋白質とのコンプレックスとは異なる位置にシフトすることがわかり、30bpに結合する蛋白質が未知の物であることが、より強く示唆された。以上の結果をまとめ、現在投稿中である。