Molecular evolution of recombinational mechanism
重组机制的分子进化
基本信息
- 批准号:07044199
- 负责人:
- 金额:$ 5.89万
- 依托单位:
- 依托单位国家:日本
- 项目类别:Grant-in-Aid for international Scientific Research
- 财政年份:1995
- 资助国家:日本
- 起止时间:1995 至 1996
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:
项目摘要
The RecA protein plays an indispensable role in genetic recombination in eubacteria. Recently, the RAD51 protein, which is homologous to the RecA protein, was found in many eukaryotes. However, functional domains and reaction mechanism of RecA/RAD51 protein remain uncertain. Since a protein from thermoresistant organisms is knows to be very stable and liable to be crystallization. Then we collected many thermoresistant microorganisms from hot springs in Russia and selected several bacterial strains, Methanosarcina sp. TS-2, Halococcus turomenicus B1734, Desulfurococcus amynoliticus, Halobacterium distributum B1733, B1739, adequate for biochemical study. Two highly conserved regions of the RecA/RAD51 proteins were chosen to synthesize oligonucleotide primers for PCR.The DNA fragments ware amplified in genomic DNAa by PCR.Using these fragments as a probe, we screened a gene bank of its genomic DNA.From the positive plaques, clones carrying the recA/RAD51 gene were selected by Southern hybridization and their nucleotide sequences ware determined. Comparison of primary structures of RecA/RAD51 proteins of archaea, eubacteria, and eukaryotes suggested that the archeal RecA/RAD51 protein may be an ancestral prototype of eubacterial and eularyotic enzymes. We also cloned the recA gene of another thermophilic bacterium, Thermus thermophilus HB8. Its gene product had fundamental activities for RecA protein. As T.thermophilus RecA protein was very stable, we succeeded in crystallization of this protein both in isolation and in the presence of DNA.Furthermore, we made truncated mutant of T.thermophilus RecA protein to prevent its aggregation at high protein concentrations. As this truncated protein was also stable, it was suitable for NMR measurements for resolving its tertiary structure.
RecA蛋白在真细菌的基因重组中起着不可或缺的作用。近年来,在许多真核生物中发现了与RecA蛋白同源的RAD51蛋白。然而,RecA/RAD51蛋白的功能结构域和反应机制仍不确定。因为来自耐热生物体的蛋白质是非常稳定的,很容易结晶。然后,我们从俄罗斯温泉中采集了许多耐热微生物,并筛选出了几株细菌,甲烷八叠球菌。TS-2、管状嗜盐球菌B1734、氨氮硫球菌、分布嗜盐杆菌B1733、B1739,适合生化研究。选择RecA/RAD51蛋白的两个高度保守的区域合成用于PCR的寡核苷酸引物,在基因组DNA中扩增DNA片段,以此为探针筛选其基因组DNA基因库,从阳性斑块中筛选携带recA/RAD51基因的克隆,进行Southern杂交并测定其核苷酸序列。古细菌、真细菌和真核生物的RecA/RAD51蛋白的一级结构比较表明,原始的RecA/RAD51蛋白可能是真细菌和真核生物酶的祖先原型。我们还克隆了另一株嗜热菌Thermus thermophilus HB8的recA基因。其基因产物对RecA蛋白具有基本活性。由于嗜热葡萄球菌RecA蛋白非常稳定,我们在分离和DNA存在的情况下都成功地结晶了该蛋白,并使其成为截短突变体,以防止其在高蛋白浓度下聚集。由于这种截短的蛋白质也是稳定的,它适合于核磁共振测量来解析它的三级结构。
项目成果
期刊论文数量(59)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Mollova,E.T.,Metzler,D.E.,Kintanar,A.,Kagamiyama,H.,Hayashi,H.,hirotsu,K.and Miyahara,I.: "Use of ^<1H>-^<15>N heteronuclear multiple-quantum coherence NMR spectroscopy to study the active site of aspartate aminotranferase" Biochemistry. 36. 615-625 (1997
Mollova,E.T.,Metzler,D.E.,Kintanar,A.,Kagamiyama,H.,Hayashi,H.,hirotsu,K. 和 Miyahara,I.:“^<1H>-^<15>N 异核多量子的使用
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- 影响因子:0
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Setoyama S., Miura, R., Nishina, Y., Shiga, K., Mizutani, H., Miyahara, I.and Hirotsu, K.: "Crystallization of ecpressed porcine kidney D-amino acid oxidase and preliminary X-ray Crystallographic characterization" J.Biochem.119. 1114-1117 (1996)
Setoyama S.、Miura, R.、Nishina, Y.、Shiga, K.、Mizutani, H.、Miyahara, I. 和 Hirotsu, K.:“压缩猪肾 D-氨基酸氧化酶的结晶和初步 X 射线
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- 通讯作者:
Kato, R., Yamamoto, N., Kito, K., and Kuramitsu, S.: "ATPase activity of UvrB protein from Thermus thermophilus HB8, and its interaction with DNA" J.Biol.Chem.271. 9612-9618 (1996)
Kato, R.、Yamamoto, N.、Kito, K. 和 Kuramitsu, S.:“来自嗜热栖热菌 HB8 的 UvrB 蛋白的 ATP 酶活性及其与 DNA 的相互作用”J.Biol.Chem.271。
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Kato,R.: "ATPase Activity of UvrB Protein from Thermus thermophilus HB8,and Its Interaction with DNA" J.Biol.Chem.(in press). (1996)
Kato,R.:“来自嗜热栖热菌 HB8 的 UvrB 蛋白的 ATP 酶活性及其与 DNA 的相互作用”J.Biol.Chem.(出版中)。
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Mollova, E.T., Metzler, D.E., Kintanar.A., Kagamiyama, H., Hayashi, H., Hirotsu, K.and Miyahara, I.: "Use of ^1H-^<15>N heteronuclear multiple-quantum coherence NMR spectroscopy to study the active site of aspartate aminotranferase" Biochemistry. 36. 615-
Mollova, E.T.、Metzler, D.E.、Kintanar.A.、Kagamiyama, H.、Hayashi, H.、Hirotsu, K. 和 Miyahara, I.:“^1H-^<15>N 异核多量子相干 NMR 的使用
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