培養細胞を用いたニフェジピン誘発歯肉増殖に関する研究

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慢性辺縁性歯周炎患者2名(A;47歳女性、B;49歳男性)より歯周外科処置時に採取した歯肉片よりアウトグロスした歯肉線維芽細胞(3〜9継代)を、各種濃度のニフェジピン、diltiazem(HERBESSOR)、アレビアチンを含む培地で一定時間培養し細胞数、コハク酸脱水素酵素活性(SDA)、ミトコンドリアの形態的変化を調べた。その結果diltiazemのみが顕著な効果を示したのでこれについてのみ詳細な実験を行った。(基本的にトリプリケ-トで実験を行った)1.SDA:濃度依存性実験では、最終濃度0,5,10,20,40,60,80及び100μg/mlのdiltiazemを添加し72時間培養した。経時的変化の実験では系列毎に培養開始より0,24,36,48,60、66及び72時間後に最終濃度が40μg/mlとなるように刺激物を加え総計72時間培養した。培養後にSDAをCelltiter96^<TM>Cell Proliferation Assay(Promega Co., USA)を用いて測定した。その結果20〜40μg/mlのdiltiazem刺激でSDAはピークを示しより濃い濃度では抑制が見られた。また、diltiazem50,100μg/ml刺激では3時間以降、25μg/ml刺激では12時間以降無刺激群に比べ有意に高いSDAを示した。0〜24時間の短時間培養では刺激群間に有意差は見られなかった。しかし48〜72時間の長時間培養では25,50μg/mlの方が100μg/ml刺激よりも有意に高いSDAを示した(p<0.05)。2.細胞数:40μg/mlのdiltiazem刺激で、3日間培養では細胞数、生細胞比率ともに刺激群と無刺激群間に有意差は認められなかったが、10日間培養では刺激群で有意に低かった。(p<0.01)3.培養上清中の蛋白濃度測定:0、3、6、12、24、48時間後の40μg/mlのdiltiazem刺激上清中の蛋白濃度を測定したところ12、24時間で有意に刺激群で高かった。((p<0.05)4.ミトコンドリア染色:カバー・スリップ上に培養した細胞をrhodamin123(10μg/ml)含有10%FBSMEMにて37℃30分培養し洗浄後チャンバー・スライドグラス上に同培地でマウントし蛍光顕微鏡(485nmUV)で観察したところ無刺激群に比べ刺激群では、ミトコンドリアは短く屈曲したものが多く、コハク酸脱水素酵素染色でより強く陽性に染まった。