分泌型IgAにおけるjoining chainの基礎的研究

分泌型IgA连接链的基础研究

• 批准号: 07771986
• 负责人: 小田 泰之
• 金额: $ 0.51万
• 依托单位: Nihon University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07771986/
• 关键词: 分泌型IgA(sIgA); joining chain(J鎖); pGEX-2T; in vitro stimulataion法; ヒトJ鎖モノクローナル抗体

本研究の今年度の結果としては研究実施計画に述べた如く,まずヒトJ鎖cDNAをPCR法を用い増幅し,得られた遺伝子をタンパク発現ベクターであるpGEX-2Tに組込み,ヒトJ鎖発現ベクターの構築を行なった。そしてこの発現ベクターを用い,宿主大腸菌(DH5_α)の形質転換を行なった結果,大腸菌内にIPTGによって強く誘導される蛋白質をSDS-PAGEによって確認し,Western blot法でこの蛋白質がヒトJ鎖融合タンパク質であることが判明し,ヒトJ鎖融合タンパクを発現させることができた。次にこの融合蛋白質の精製を行なったが,発現している融合タンパク質は大部分が不溶性であったことから,各種海面活性剤および培養温度の違いによる融合タンパク質の溶解度について検討し,アフィニティーカラムを用いた精製に及ぼす影響について検討した。その結果,25℃で培養した大腸菌から0.1%SDSを用い,精製した場合,少量ではあるが精製度の高いヒトJ鎖融合タンパク質を得ることができた。しかしこの蛋白質はトロンビンによる消化が困難であったため実施計画に述べたヒトJ鎖タンパクの分離精製は困難であった。そこでトロンビンによる消化を行なわずヒトJ鎖融合タンパク質を免疫原としてモノクローナル抗体の作製を試みた。融合タンパクの精製は先に述べた通り少量であったため,in vitro stimulation法による免疫を行ない,マウス抗ヒトJ鎖モノクローナル抗体の作製を行なった。ヒトJ鎖と反応する抗体を得ることができたが,得られた抗体は本研究の免疫法にin vitro stimulation法を用いたためIgMクラスであり,抗体の精製や親和性の点において不利な点があった。今後は大量の免疫原としての融合タンパク質の精製法を検討し,より有用性の高い抗体の作製が課題となる。

の our の results this study と し て は research be applied plan に above べ た く, ま ず ヒ ト J lock cDNA を を PCR method with い raised し, too ら れ た posthumous son 伝 を タ ン パ ク 発 now ベ ク タ ー で あ る pGEX - 2 t に group 込 み, ヒ ト J lock 発 now ベ ク タ ー の line build を な っ た. そ し て こ の 発 now ベ ク タ ー を い, host coliform (DH5_ alpha) の form quality planning in line を な っ た as a result, the coliform in に IPTG に よ っ て strong く induced さ れ る を sds-page protein に よ っ て confirm し, Western Blot method で こ の protein が ヒ ト lock J integration タ ン パ ク qualitative で あ る こ と が determine し, ヒ ト lock J integration タ ン パ ク を 発 now さ せ る こ と が で き た. Time に こ の fusion protein の refined を line な っ た が, 発 now し て い る fusion タ ン パ ク qualitative は most が insoluble で あ っ た こ と か ら, all kinds of surface active tonic お よ び temperature の violations い に よ る fusion タ ン パ ク qualitative の solubility に つ い て 検 for し, ア フ ィ ニ テ ィ ー カ ラ ム を with い た refined に and ぼ す influence に つ い て beg し 検 た. そ の results, 25 ℃ で cultivate し た coliform か ら 0.1% SDS を い, refined し た occasion, a small amount of で は あ る が high pure system の い ヒ ト lock J integration タ ン パ ク qualitative を must る こ と が で き た. し か し こ の protein は ト ロ ン ビ ン に よ る difficult digest が で あ っ た た め be applied plan に above べ た ヒ ト J lock タ ン パ ク の difficult separation of refined は で あ っ た. そ こ で ト ロ ン ビ ン に よ る line digestion を な わ ず ヒ ト lock J integration タ ン パ ク qualitative を immunogen と し て モ ノ ク ロ ー ナ ル を try the antibody の cropping み た. Fusion タ ン パ ク の refined は に first mentioned べ た tong り small で あ っ た た め, the in vitro stimulation method に よ る immune を line な い, マ ウ ス resistance ヒ ト J lock モ ノ ク ロ ー ナ ル を line the antibody の cropping な っ た. ヒ ト J lock と anti 応 す を る antibodies to る こ と が で き た が, too ら れ た antibody は に の immune method this research in vitro stimulation method を with い た た め IgM ク ラ ス で あ り, antibody の refined や affinity の point に お い て adverse な point が あ っ た. In the future, the research will focus on the が project of preparing <s:1> highly useful <s:1> antibodies against <s:1> by fusing <s:1> large quantities of <s:1> immunogens と て て <e:1> <s:1> with タ パ パ through the refining method of plasticization を検.