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過シュウ酸エステル化学発光-写真検出を利用した核酸プローブ法の遺伝子診断への応用

过草酸盐化学发光-光检测核酸探针法在基因诊断中的应用

基本信息

批准号：
07772134
负责人：
黒田直敬
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Nagasaki University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

過シュウ酸エステル化学発光-写真検出による核酸プローブ法の開発にあたり、以下のモデルシステムを用いて化学発光検出のための検討を行った。蛍光標識試薬には、一級アミンと選択的に反応して発蛍光体となることが知られており、かつ過シュウ酸エステル化学発光(PO-CL)法で強い発光が得られることが判明しているナフタレン-2,3-ジカルボキシアルデヒド(NDA)を用いた。また、標識対象のモデル化合物として、シクロヘキシルアミン(CHA)と5'末端側に一級アミンを導入したDNAオリゴマー(15-mer)を選択した。この両化合物をNDAで標識し、精製したのち、それらの蛍光特性・化学発光特性を調べた。この両者の蛍光を測定したところ、いずれも490nm近辺に極大を有する蛍光が得られたが、15-merの蛍光強度はCHAの約40%であった。次にこれらを用いて化学発光に関する検討を行った。PO-CLの写真法による検出においては、精度のよい結果を得るために、長寿命の発光が要求される。そこでまず、11種類のシュウ酸エステルを使用して、発光パターンの測定をバッチ法で行った。その結果、bis-(2,6-difluorophenyl)oxalate(DFPO)とbis[2-(3,6-dioxaheptyloxycarbony1)-4-bromopheny 1]oxalate(DOPO)で比較的長寿命の発光が得られたため、DFPOを用いてさらに詳細な検討を行った。最終的には1.5mM DFPO、5mM過酸化水素及び2.5μMトリエチルアミンの組成からなる25% t-BuOHを含むジメチルフタル酸溶液中で最も良い結果が得られた。このときの発光パターンは、発光開始後約2分に極大を有しており、約25分までは発光が観測された。この条件を用いて、メンブラン(ハイボンドN+)上にスポットした15-merの写真検出を試みた。Polaroid 667フィルムを装填したカメラルミノメーターを使用し、40分間露光した場合、少なくとも250フェムトモル/スポットまでの15-merが検出可能であった。今後、実際のハイブリダイゼーション操作を含む核酸プローブ法への適用を図っていく予定である。

The chemical photoluminescence-photo photo shows that the nucleic acid chemical reaction method is used to start the chemical reaction, and the following chemical photoluminescence method is used to display the chemical luminescence. The light-emitting device, the first-level optical device, the light source, the light, the light, the light This is the first step at the end of the 5 'end of the CHA. The first step is to enter the DNA compound (15-mer) to select the target. Chemical properties of NDA compounds, chemical properties of light, chemical properties of light, chemical properties of light. The optical intensity of 490nm is about 40%, the optical intensity of 15-mer is about 40%, and the optical intensity is about 40%. In the second place, the chemical method is used in this paper. The PO-CL photo method is used to determine the accuracy, accuracy, and long-life requirements. In the first half of this year, we need to use this method to determine the accuracy of the method. The results showed that the long-life phosphorescence of bis- (2-(3-dioxaheptyloxycarbony1)-4-bromopheny 1] oxalate (DOPO) long-life phosphorescence was better than that of bis- (2-(3-dioxaheptyloxycarbony1)-4-bromopheny). The results showed that the long-life phosphorescence of oxalate (DOPO) was successful. The most effective 1.5mM DFPO, 5mM filter acidified water and 2.5 μ M sodium chloride make up 25% t-BuOH with the best results in the acid solution. After the lighting starts, there are about 2 minutes and 25 minutes after the opening of the light. You will try to use a photo shot of 15-mer in the following conditions: please click, click