過シュウ酸エステル化学発光-写真検出を利用した核酸プローブ法の遺伝子診断への応用

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過シュウ酸エステル化学発光-写真検出による核酸プローブ法の開発にあたり、以下のモデルシステムを用いて化学発光検出のための検討を行った。蛍光標識試薬には、一級アミンと選択的に反応して発蛍光体となることが知られており、かつ過シュウ酸エステル化学発光(PO-CL)法で強い発光が得られることが判明しているナフタレン-2,3-ジカルボキシアルデヒド(NDA)を用いた。また、標識対象のモデル化合物として、シクロヘキシルアミン(CHA)と5'末端側に一級アミンを導入したDNAオリゴマー(15-mer)を選択した。この両化合物をNDAで標識し、精製したのち、それらの蛍光特性・化学発光特性を調べた。この両者の蛍光を測定したところ、いずれも490nm近辺に極大を有する蛍光が得られたが、15-merの蛍光強度はCHAの約40%であった。次にこれらを用いて化学発光に関する検討を行った。PO-CLの写真法による検出においては、精度のよい結果を得るために、長寿命の発光が要求される。そこでまず、11種類のシュウ酸エステルを使用して、発光パターンの測定をバッチ法で行った。その結果、bis-(2,6-difluorophenyl)oxalate(DFPO)とbis[2-(3,6-dioxaheptyloxycarbony1)-4-bromopheny 1]oxalate(DOPO)で比較的長寿命の発光が得られたため、DFPOを用いてさらに詳細な検討を行った。最終的には1.5mM DFPO、5mM過酸化水素及び2.5μMトリエチルアミンの組成からなる25% t-BuOHを含むジメチルフタル酸溶液中で最も良い結果が得られた。このときの発光パターンは、発光開始後約2分に極大を有しており、約25分までは発光が観測された。この条件を用いて、メンブラン(ハイボンドN+)上にスポットした15-merの写真検出を試みた。Polaroid 667フィルムを装填したカメラルミノメーターを使用し、40分間露光した場合、少なくとも250フェムトモル/スポットまでの15-merが検出可能であった。今後、実際のハイブリダイゼーション操作を含む核酸プローブ法への適用を図っていく予定である。