Pseudomonas syringaeのエナレン生成酵素の結晶化

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Pseudomonas syringae pv. phaseolicola PK2株由来エチレン生成酵素(EFE)遺伝子を高発現ベクターpkk223-3に連結したプラスミドpKEFE1で形質転換した大腸菌、E. coli DH5αをLB培地を用いて培養し、菌体を超音波破砕後、親株由来EFEと同様の酵素精製法(ストレプトマイシン処理ならびにButyl Toyopearl 650M, DEAE-Sepharose CL-6B, Bio Gel HTP,Sephadex G-100の各種カラムクロマトグラフィーを使用する)で精製を試みたが、純品の酵素標品が得られなかった。そこで使用するカラムクロマトグラフィーを再検討した結果、ストレプトマイシン処理後、DEAE-Sepharose CL-6B,Bio Gel HTPカラムクロマトグラフィーの順番でカラムを使用することで精製が可能となった。培養液1リットルあたり約20mgのEFEを調製することが可能となったが、得られた精製酵素標品はSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動的には一本のバンドを示すものの、酵素溶液を20mg/ml酵素溶液にまで濃縮すると青色を呈していた。親株のEFEでは、10mg/ml酵素溶液まで濃縮しても無色であることから、この着色現象は大腸菌を用いての高発現に原因が考えられた。現在、この着色精製酵素標品と親株培養液18リットル分から調製した精製酵素標品を各濃度に調整し、25℃と4℃で、種々の沈殿剤、溶媒を使用して結晶化を試みているが、着色、無色の酵素標品にかかわらず硫酸アンモニウムなどの沈殿剤の添加により、酵素溶液がすぐに白濁してしまい、結晶化には至っていない。