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酸素感受性エチレン生成酵素の結晶化と機能改変のための分子設計

氧敏感乙烯形成酶的结晶和功能修饰的分子设计

基本信息

批准号：
11750697
负责人：
長濱一弘
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Sojo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

Pseudomonas syringae pv.phaseolicola PK2株由来エチレン生成酵素(EFE)は酸素感受性の自殺方酵素である。本菌株のEFE遺伝子を高発現ベクターpKK223-3に連結したプラスミドpKEFE1で形質転換した大腸菌、E.coli JM109をLB培地を用いて培養し、菌体を超音波破砕後、ストレプトマイシン処理、DEAE-Sepharose CL-6B,Bio Gel HTPカラムクロマトグラフィーの順番でカラムを使用することでSDS-PAGEで純度の高い酵素標品を得ることが可能となった。しかしEFE抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果から標品中の一部のEFEが分解していることが示唆された。酵素精製にかかる時間の短縮化のため、各種HPLCカラムを使用したが上述の精製法同様、酵素の分解を防ぐことができなかった。本酵素標品を用いて種々の沈殿剤、溶媒を使用して結晶化を試みているが、硫酸アンモニウムなどの沈殿剤の添加により、酵素溶液がすぐに白濁してしまい、結晶化には至っていない。一方、機能改変の分子設計としては我々のEFEの一次配列に相同性を持つタンパク質が結晶化されたことからその結果を元にして酵素と基質の結合場所を配列上で確認した。その結果、EFEでも保存された配列が数箇所認められたので、5箇所に部位特異的変異を導入し、エチレン生成酵素活性に及ぼす影響の検討を行った。その結果、ほとんどの変異導入で酵素活性が失われたものの、1箇所だけ野生型の酵素に比べて4倍の比活性を持つ酵素を構築する変異を導入することが出来た。しかしこの変異型酵素は野生型以上に不安定であり、透析、凍結操作後、完全に失活してしまった。現在、酵素の安定な精製方法について検討中である。

Pseudomonas syringae pv.phaseolicola PK2 strain is derived from an acid-sensitive enzyme called EFE. The EFE gene of this strain is highly expressed in pKK223 -3, pKEFE1, E.coli JM109, LB culture, ultrasonic disruption, DEAE-Sepharose CL-6B,Bio Gel HTP, and SDS-PAGE. The EFE antibody was used in the analysis of the results. The enzyme purification method is similar to the above purification method, and the enzyme decomposition method is similar to the above purification method. The enzyme standard is prepared by using a precipitation agent, a solvent, a crystallization agent, sulfuric acid, a precipitation agent, an enzyme solution, and a crystallization agent. The molecular design of a functional modification and the identification of the primary alignment of EFE The results, EFE, and the corresponding sequences were identified, and five site-specific variations were introduced, and enzyme activity and its effects were discussed. As a result, the enzyme activity was lost and 1 of the wild-type enzymes was 4-fold higher than that of the wild-type enzyme. The enzyme is unstable, dialysis, and completely inactivated after freezing. Now, enzyme stability and purification methods are discussed.