遺伝子工学法によるカンキツbrownspot病菌細胞壁分解酵素の病理学的評価

基因工程方法对柑橘褐斑病细胞壁降解酶的病理学评价

• 批准号: 07760049
• 负责人: 秋光 和也
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kagawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07760049/
• 关键词: カンキツ; brown spot病; 細胞壁分解酵素; 蛋白質分解酵素; ポリガラクツロナーゼ; 糸状菌; アルタナリア属菌; 宿主特異的毒素

植物病原糸状菌の生成する細胞壁分解酵素は,植物への感染時に細胞壁構成成分を分解して菌の細胞内への侵入を容易にし,感染成立のための病原性機能のひとつとして働く可能性をもつ。本研究においては,遺伝子操作のシステムが確立しているAlternaria属菌のカンキツbrown spot病菌を用い,本菌の生成する細胞壁分解酵素の精製,遺伝子のクローニング,およびその遺伝子を用いた遺伝子破壊法による本酵素の病理学的評価を行う。本年度は、蛋白質分解酵素の基質としてスキムミルクを含んだ液体培地にて本菌を静置培養し,そのろ液中に本菌が生成した酵素を純化した。酵素精製においては,各種蛋白純化カラムを用いて高速液体クロマトグラフィーを行なった。本研究費の申請後から現在までにすでに2つの異なるプロテアーゼの単離に成功した。その他,ペクチンを基質として本菌を静置培養し,ろ液に分泌されたポリガラクツロナーゼ(PG)の単離にも成功した。これらの単離酵素は,それぞれSDS-PAGEで単一バンドとして確認された。単離した酵素は,次に酵素分子中の部分的なアミノ酸配列を決定に用いている。先に単離した蛋白質分解酵素の1つについてはN末端からのアミノ酸配列決定を試みたが,N末端がブロックされていたため現在トリプシン処理により本酵素由来のポリペプチド断片をつくり,それら断片からのアミノ酸配列の決定を試みている。配列決定後は,その配列をもとにオリゴヌクレオチドを合成して本酵素遺伝子単離のためのプローブまたはPCRのプライマーとしてもちいる。PGについては,近系糸状菌のPG遺伝子が本菌のPG遺伝子と強くハイブリダイズすることが明らかとなったので,現在これをヘテロロガスなプローブとして用いゲノムライブラリーをスクリーニングしている。これらの結果は,日本植物病理学会全国大会(平成8年春大会)および関西部会(平成7年秋大会)にてすでに発表した。

Cell-wall decomposing enzymes that produce plant pathogenic bacteria break down cell wall components during infection in plants, making it easier for bacteria to invade into the cells, thus limiting the possibility of pathogenic functions during the establishment of infection. In this study, we established the genetic manipulation of Alternaria spp. and its use in brown spot bacteria, purification of cell wall decomposing enzymes produced by this strain, genetic modification of Alternaria spp., and pathological evaluation of this enzyme using the genetic modification method. This year, the substrate of proteolytic enzyme was purified by culture in liquid medium, and the enzyme was produced in liquid medium. Enzyme purification, protein purification, high speed liquid purification This research fee was applied for and now it is successful. In addition, the bacteria were cultured in static culture, and the secretion of the supernatant was successful. The enzyme was identified by SDS-PAGE. The enzyme in question is a part of the enzyme molecule that is used to determine the acid sequence. The first step is to isolate the proteolytic enzyme and determine the acid alignment of the N-terminal fragment. The second step is to isolate the proteolytic enzyme and determine the acid alignment of the N-terminal fragment. After the sequence is determined, the sequence is changed to the sequence of the enzyme. The PG gene of a closely related bacterium is the PG gene of the bacterium. The PG gene of the bacterium is strong. The PG gene of the bacterium is strong. The results were presented at the National Congress of the Japanese Society of Plant Pathology (Heisei 8th Spring Conference) and the Seki Western Conference (Heisei 7th Autumn Conference).

项目成果

J.D.Walton: "Advances in Molecular Genetics of Plant-Microbe Interactions" International Society of Molecular Plant-Microbe Interactions, 415 (1995)

J.D.Walton：“植物-微生物相互作用的分子遗传学进展”国际植物-微生物分子相互作用学会，415（1995）

秋光 和也: "植物感染機構の進化を考える" 日本植物病理学会, 119 (1995)

Kazuya Akimitsu：“考虑植物感染机制的进化”日本植物病理学会，119（1995）

J.D.Walton: "Pathogenesis and Host Specificity in Plant Diseases Volume II Eukaryotes" Pergamon, 407 (1995)

J.D.Walton：“植物病害第二卷真核生物的发病机制和宿主特异性”Pergamon，407 (1995)

秋光 和也: "カンキツbrown spot病菌の生成する植物細胞壁分解酵素に関する研究(1)蛋白質分解酵素の純化" 日本植物病理学会報. 61. 615 (1995)

Kazuya Akimitsu：“柑橘褐斑病菌产生的植物细胞壁降解酶的研究（1）蛋白水解酶的纯化”日本植物病理学会会报61. 615（1995）。

秋光 和也: "カンキツbrown spot病菌の生成する植物細胞壁分解酵素に関する研究(2)ポリガラクツロナーゼの精製とその遺伝子のクローニング" 日本植物病理学会報. 62(発表予定). (1996)

秋光一也：“柑橘褐斑病菌产生的植物细胞壁降解酶的研究（2）多聚半乳糖醛酸酶的纯化及其基因的克隆”日本植物病理学会会刊62（待出版）。