標的遺伝子破壊法を用いた病原糸状菌の生成する植物細胞壁分解酵素の病理学的評価

利用靶向基因破坏方法对病原真菌产生的植物细胞壁降解酶进行病理学评价

• 批准号: 08760046
• 负责人: 秋光 和也
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Kagawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08760046/
• 关键词: カンキツ; Brown spot病; 細胞壁分解酵素; エンドポリガラクツロナーゼ; アルカリ性プロテアーゼ; 糸状菌; アルタナリア属菌; 宿主特異的毒素

カンキツbrown spot病菌は,近年多くのカンキツ栽培国で重要な病害となっている。本病の病原性決定因子は宿主特異的ACR毒素と考えられているが,その他の病原,病徴因子については何の報告もない。本研究においては毒素以外の病原,病徴因子として,本菌の分泌する細胞壁分解酵素の単離,生化学的諸性質,遺伝子クローニングおよび遺伝子破壊法による酵素の病理学的評価を目的とした。ポリガラクツロナーゼ(PG)に関する研究では,ヘテロロガスプローブを用いた本菌染色体遺伝子のサザンブロット解析により,本酵素遺伝子は単一である可能性が示された。また本菌の培養ろ液にはPG活性を示す画分は一つしかなく,この画分を単離したところendo型のPGであることが明らかとなった。単離には硫安沈殿,CMsepharose,イオン交換HPLC,ゲルろ過HPLCを用い,培養ろ液2.5Lから約230μgのPGを単離し,精製における比活性は粗抽出液に対して30倍であった。この単離endoPGはSDS-PAGEでの分子量6万,等電点8.8の糖蛋白であり,至適pHは5でKm値とVmax値はそれぞれ0.1mg/ml,4.76*10^<-3>mmol/min/mgであった。本endoPGのN末端アミノ酸配列は,GPDDIYAと決定した。この配列中のDDIYAと,現在までに報告されている糸状菌のendoPG遺伝子のアミノ酸配列情報の相同性検索により得たモチーフNQDDCを基にPCRプライマーを合成した。これらのプライマーを用いて本菌の染色体遺伝子を鋳型にPCRを行ったところ,予測されるサイズである約700bpの遺伝子が増幅され,この遺伝子は先にサザンブロット解析に用いたヘテロロガスプローブと強くハイブリダイズし,染色体遺伝子解析で確認した単一遺伝子と同じ遺伝子であることを確認した。現在この遺伝子を用いて相同組換えを介した遺伝子破壊法が進展中である。また本遺伝子の配列決定,_cDNA,ゲノムライブラリーのスクリーニングも順調に進行している。本菌の分泌するプロテアーゼについても染色体遺伝子解析により少なくとも5つ以上の遺伝子の存在を確認し,ろ液中から5つの酵素活性画分を検出し,このうち3画分を単離した。これらはいずれもアルカリ性プロテアーゼで,一つはセリン型プロテアーゼでプロテア-デKに類することを阻害剤検定で明らかにした。

In recent years, most of the major diseases in cultivated countries have been caused by brown spot bacteria. The pathogenic determinant of the disease, the host specific ACR toxin, the pathogen, the host specific toxin, the pathogen, the pathogen. In this study, except for toxins, pathogens, pathogens, cell wall decomposing enzymes, biochemical properties, biochemical properties, pathogens, cell wall decomposing enzymes, biochemical properties, biochemical properties, pathogens, cell wall decomposing enzymes, biochemical properties, biochemical properties, pathogens, pathogens, pathogens This enzyme was used to analyze the chromosomes of this fungus (PG). In this study, the chromosomes of this fungus were analyzed, and the possibility was analyzed. The activity of PG in the culture solution of this bacteria shows that the picture is divided into several parts, and the drawing is divided into two parts: the temperature, the temperature and the temperature. Get out of the thiamine chamber, CMsepharose, communicate with HPLC, use it through HPLC, culture solution 2.5L, about 230 μ g PG, extract more than 30 times the activity of the crude extract. The molecular weight of the isolated endoPG SDS-PAGE is 60 000, and the isoelectric point is 8.8%. The isoelectric point is 4.76 * 10 ^ & the lt;-3>mmol/min/mg temperature is 4.76 * 10 ^. When the pH is 5 times Km, the Vmax temperature is 0.1mg. The N-terminal acid configuration of this endoPG is determined by GPDDIYA. There is a DDIYA in the configuration. Now, the report reports that the bacteria are endoPG, the bacteria are acidic, the homogeneity is the same, the PCR is the same, and the synthesis is the same. In the case of the bacteria, the chromosomes of the bacteria were divided into two types: the PCR type, the chromosome type, the PCR type, the chromosome type, the size, the size, the size Chromosome analysis to confirm that the first child is the same as the child. At present, we are in the process of using the same system to make sure that we are using the same method. The configuration of this sub-column determines that, _ cDNA, please do not know how to make a decision. In this bacteria, there is a confirmation that there is an enzyme activity in the liquid, the activity of the enzyme in the liquid, and the separation of the active enzyme in the liquid, there is a confirmation that there is a confirmation in the chromosome analysis of the chromosome. I don't know what to do. I don't know. I don't know what to do. I don't know what to do.

项目成果

一色 淳憲等: "カンキツbrown spot病菌の生成する植物細胞壁分解酵素に関する研究(IV)ポリガラクツロナーゼの諸性質とクローニング" 日本植物病理学会報. 63(発表予定). (1997)

Atsushi Isshiki等：“柑橘褐斑病菌产生的植物细胞壁降解酶的研究（IV）特性和多聚半乳糖醛酸酶的克隆”日本植物病理学会会刊63（待出版）。

Akimitsu K.,et al.: "Molecular Aspects of Pathogenicity and Resistance: Requirement for Signal Transduction" APS Press, 273 (1996)

Akimitsu K. 等人：“致病性和耐药性的分子方面：信号转导的要求”APS Press，273 (1996)

Isshiki A.,et al.: "Purification and Characterization of Endopolygalacturonase from Rough Lemon Pathotype of Alternaria alternata" Physiol Mol Plant Pathol. 49(発表予定). (1997)

Isshiki A. 等人：“链格孢粗柠檬致病型的内聚半乳糖醛酸酶的纯化和表征”Physiol Mol Plant Pathol 49（待出版）。

秋光 和也等: "カンキツbrown spot病菌の生成する植物細胞壁分解酵素に関する研究(II)ポリガラクツロナーゼの精製とその遺伝子のクローニング" 日本植物病理学会報. 62(3). 300 (1996)

Kazuya Akimitsu等：“柑橘褐斑病菌产生的植物细胞壁降解酶的研究(II)多聚半乳糖醛酸酶的纯化及其基因的克隆”日本植物病理学会通报62(3)。

一色 淳憲等: "カンキツbrown spot病菌の生成する植物細胞壁分解酵素に関する研究(III)ポリガラクツロナーゼとその遺伝子クローニング" 日本植物病理学会報. 62(6). 622 (1996)

Atsushi Isshiki等人：“柑橘褐斑病菌产生的植物细胞壁降解酶的研究(III)多聚半乳糖醛酸酶及其基因克隆”日本植物病理学会通报62(6)622(1996)。