ヌクレオシドーリン酸キナーゼ基質認識機構の解析

点击翻译按钮获取中文摘要

本研究では、アデニル酸キナーゼ及びUMP-CMPキナーゼという基質特異性の異なる相同酵素について、構造と機能の相関を比較することにより両酵素の基質特異性の差がどのような認識機構によるものかを分子レベルで解明することを目的とした。当該年度までに、両酵素対象として、ある程度基質特異性が改変された変異型酵素やキメラ酵素が得られているので、NMRなどの手法を用いて、より詳細に各種ヌクレオチドとの相互作用及びその立体構造を解析し、両酵素の基質認識機構を解明した。アデニル酸キナーゼのAMP結合ドメインを導入したキメラ型UMP-CMPキナーゼにおいては、AMPに対する反応効率がUMPに対する値の約7倍にまで増大していた。詳細な反応速度論的な解析の結果、この基質特異性の変化は主に反応速度の増大によることが判明した。また、2次元プロトンNMRスペクトルを測定した結果によると、導入したAMP結合ドメイン以外の領域に、大きな構造の変化は生じていないと考えられた。UMP-CMPキナーゼにおいて塩基の識別に関与する残基を、アデニル酸キナーゼと同一な残基へ変換することによっても、UMP-CMPキナーゼの基質特異性がどのように変化するのか調べた。その結果、単独の変異導入によっては基質特異性はそれほど大きく変化しないが、少なくとも3ケ所の変異を同時に導入することによって、基質特異性が大きくAMP特異的に変化することが判明した。これらの結果は、様々な変異導入や機能ドメインの交換によって、ヌクレオシドーリン酸キナーゼの基質特異性の改変が十分可能であることを示している。当該年度のこれらの研究結果は、その一部を含めた成果を本年度のJ.Biochemistryにおいて、すでに発表している。残りのデータに関しても、来年度中に論文としてまとめ、投稿する予定である。