ラジカル架橋酵素により構築した生理活性環状化ペプチドの作用機構解析と最適化

酵素の翻訳後修飾に関わるラジカル架橋酵素QhpDは、タンパク質に分子内チオエーテル架橋を形成し、ループ型環状構造を多重に作り出すことができる。本研究は、このQhpDを利用することによって、酵素的なペプチド環状化手法を開発し、新規な機能性を持つ環状ペプチドを作り出すことを目的とする。すなわち、新しい中分子創薬のフレームワークとして重要な意義がある。まず、アラニン残基を連続したAla環状化ペプチドの動物細胞に対する作用の解析、あるいは物理化学的な解析を行うために、(Ala)4, (Ala)5, (Ala)6ペプチドの調製を行なった。特にNMRによる2価金属イオンとの相互作用解析に多量の試料が必要とされることが判明しており、本年度においてその調製に注力した。概ね次年度より本格的な解析を開始できるものと考えている。さらに、架橋酵素QhpDの発現を制御し、架橋ペプチドの環状化をon/offできる共発現系の構築を試みた。当初計画では、QhpDの発現制御を、大腸菌コールドショック遺伝子cspAのプロモーター配列（pColdベクター使用）で行うことを計画していたが、pColdベクターの誘導条件である15 ℃では、T7プロモーター支配下の架橋ペプチドの発現が停止し、共発現系が想定通りに機能しなかった。そこで、QhpDの発現制御を、pBADプラスミド上でアラビノースプロモーター支配下で行うようにした。その結果、IPTG誘導下架橋ペプチドを発現下させているところに、アラビノースの有無によって、架橋酵素の発現をon/offできることがわかった。本系を用いることで、新規抗菌性ペプチドの探索に向けた基盤を確立することができた。

酵素の翻訳後修飾に関わるラジカル架橋酵素QhpDは、タンパク質に分子内チオエーテル架橋を形成し、ループ型環状構造を多重に作り出すことができる。本研究は、このQhpDを利用することによって、酵素的なペプチド環状化手法を開発し、新規な機能性を持つ環状ペプチドを作り出すことを目的とする。すなわち、新しい中分子創薬のフレームワークとして重要な意義がある。まず、アラニン残基を連続したAla環状化ペプチドの動物細胞に対する作用の解析、あるいは物理化学的な解析を行うために、(Ala)4, (Ala)5, (Ala)6ペプチドの調製を行なった。特にNMRによる2価金属イオンとの相互作用解析に多量の試料が必要とされることが判明しており、本年度においてその調製に注力した。概ね次年度より本格的な解析を開始できるものと考えている。さらに、架橋酵素QhpDの発現を制御し、架橋ペプチドの環状化をon/offできる共発現系の構築を試みた。当初計画では、QhpDの発現制御を、大腸菌コールドショック遺伝子cspAのプロモーター配列（pColdベクター使用）で行うことを計画していたが、pColdベクターの誘導条件である15 ℃では、T7プロモーター支配下の架橋ペプチドの発現が停止し、共発現系が想定通りに機能しなかった。そこで、QhpDの発現制御を、pBADプラスミド上でアラビノースプロモーター支配下で行うようにした。その結果、IPTG誘導下架橋ペプチドを発現下させているところに、アラビノースの有無によって、架橋酵素の発現をon/offできることがわかった。本系を用いることで、新規抗菌性ペプチドの探索に向けた基盤を確立することができた。